HPLC 法测定复方鲜竹沥液中南烛木树脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷的含量*

肖小武，潘 蕾，林凯鹏，付辉政，周志强

（江西省药品检验检测研究院江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西南昌 330029）

复方鲜竹沥液具有清热化痰、止咳的功效，临床上主要用于痰热咳嗽、痰黄黏稠等，处方是由鲜竹沥、鱼腥草、生半夏、生姜、枇杷叶，桔梗以及薄荷素油组成，方中鲜竹沥为君药，占比40%[1-3]。复方鲜竹沥液现行质量标准收载在《中国药典》2020 年版（一部），标准中仅对鱼腥草、枇杷叶以及桔梗3 味药进行了鉴别控制，并未对占处方量最大的君药鲜竹沥进行控制[4]，且收载在《中华人民共和国卫生部药品标准》（1992 版）的鲜竹沥质量标准也仅有性状、以酪氨酸为对照的薄层色谱鉴别及pH 值等检查项[5]。上述标准控制技术水平较低，标准落后，均难以有效控制产品的质量，直接影响鲜竹沥及其复方制剂临床用药的有效性和安全性。南烛木树脂酚-3α-O-βd-葡萄糖苷是课题组在鲜竹沥中提取分离出的指标成分[6-8]，且也为竹子中的成分[9，10]。据课题组调研得知，市场上鲜竹沥工艺混乱，存在严重价格倒挂现象。因此，建立鲜竹沥及其复方制剂中指标成分南烛木树脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷的质量控制项目可保证鲜竹沥的来源真实性。本实验在课题组前期研究基础上参考文献[ 11，12 ]建立了复方鲜竹沥液中指标成分南烛木树脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷的含量的HPLC 测定方法，可为复方鲜竹沥液的质量标准研究以及质量评价提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260II 型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；Sartorius BSA 124S-CW 型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；C apcell pak C18柱（250mm×4.6mm×5μm,资生堂）。

南烛木树脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷为实验室自制，且经标化纯度为98.2%。复方鲜竹沥液来自生产、流通以及使用环节的市场抽样，覆盖了市场上全部在生产的5 家生产企业。阴性样品为按照复方鲜竹沥液生产工艺制备不含鲜竹沥的阴性样品。

乙腈（色谱纯迪马科技有限公司）；H3PO4、甲醇、正丁醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为资生堂capcell pak C18（250mm×4.6mm×5μm）, 以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B,按表1 中的规定进行梯度洗脱；流速为1mL·min-1；柱温为30℃,进样量为10μL,检测波长为220nm。

表1 流动相洗脱程序Tab.1 Mobile phase elution procedure

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品南烛木树脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷14.15mg，置于25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品母液；精密吸取上述溶液5mL 置于50mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.3 供试品溶液的制备 精密量取本品50mL，用水饱和的正丁醇振摇提取4 次，每次50mL,合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加入甲醇，溶解后转移至25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.4 阴性样品溶液的制备 按照处方工艺，制备不含鲜竹沥药材的阴性样品，按照1.2.3 项下供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的确定

本实验最初考察了未经处理的原液进样测定，但因基质复杂难以分离，且样品含糖量较高，对色谱柱损伤较大。因此，实验考察了乙酸乙酯、水饱和的正丁醇萃取以及大孔树脂柱层析等前处理方式，结果发现，用同比体积水饱和的正丁醇萃取4 次的方法简单、方便且准确度高，故实验采用水饱和的正丁醇萃取的前处理方法。

2.2 检测波长的确定

取对照品溶液用DAD 检测器对（+）-南烛木树脂酚-3α-O-β-d-吡喃葡萄糖苷对照品与样品溶液中与（+）-南烛木树脂酚-3α-O-β-d 吡喃葡萄糖苷对照品相应位置上色谱峰在400～200nm 波长范围内进行光谱扫描，结果显示，（+）-南烛木树脂酚-3α-O-β-d-吡喃葡萄糖苷在210nm 波长处有最大吸收。由于210nm 处于末端吸收，干扰较大，故选择220nm 作为检测波长。

2.3 专属性实验考察

取对照品、供试品以及阴性样品溶液按照1.2.1条件进行测定，结果对照品与供试品溶液中南烛木树脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷色谱峰理论塔板数均大于5000，且复方鲜竹沥液中其他成分对南烛木树脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷色谱峰无干扰（图1），表明方法的专属性强。

图1 专属性实验色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of specificity test

2.4 线性关系考察

精密吸取上述对照品母液10、15、20μL 以及对照品溶液2、5μL 注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，以进样量为横坐标进行回归计算并绘制标准曲线，南烛木树脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷的回归方程为Y=6090.7X+283.79，R2=0.9999,说明南烛木树脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷在0.2264~11.32μg·mL-1之间线性关系良好。

2.5 精密度实验

精密吸取对照品溶液，注入液相色谱仪，连续测定6 次，结果对照品峰面积RSD 为0.43%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验

取本品（S1）6 份，依照1.2 实验方法制备供试品溶液并进行测定，结果供试品溶液中南烛木树脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷含量平均值为22.78μg·mL-1，RSD 为1.67%，结果表明，该方法具有较好的重复性。

2.7 稳定性实验

取本品（S1）1 份，依照1.2 实验方法制备供试品溶液，分别在0、4、8、12、18、24h 进行测定，结果南烛木树脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷峰面积的RSD 为1.09%，表明南烛木树脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷峰在24h 内稳定性较好。

2.8 加标回收实验

采用加样回收实验，精密量取已知含量的本品（S1）25mL, 按相对于本品的80%、100%、120% 3 个含量比例精密添加南烛木树脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷对照品溶液，按“1.2.3”项下供试品溶液制备方法制备，并照“1.2.1”项下条件测定，计算回收率，结果见表2。

表2 加标回收率实验结果Tab.2 Result of recovery experiments

由表2 可见，南烛木树脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷的平均回收率为97.06%，RSD 为1.08%。表明方法回收率良好。

2.9 实际样品测定

按上述拟定的方法，对收集样品中南烛木树脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷的含量进行测定，结果发现，D 企业的6 批次样品南烛木树脂酚-3α-O-β-d-吡喃葡萄糖的含量远高于其他4 家企业。根据课题组调研得知，因鲜竹沥温度等生产工艺参数不固定，导致其成分含量差别较大，且该企业投料的鲜竹沥来源不同于其他4 家生产企业，故其含量明显偏高。结果见表3。

表3 样品测定结果（n=4）Tab.3 Result of sample test

由表3 可见，同时采用该方法对市场上在生产的5 家企业的多批次样品中南烛木树脂酚-3α-Oβ-d-葡萄糖苷含量进行测定，从样品测定结果可知其含量范围为16.97~84.65μg·mL-1，平均含量为34.43μg·mL-1，考虑到鲜竹沥生产工艺差异等，故拟定其限度以平均值的70%计，即34.43*70%=24μg·-1mL，暂定本品每1ml 含南烛木树脂酚-3α-O-β-d-吡喃葡萄糖不得少于24μg。

3 结论

本研究选择鲜竹沥中指标成分南烛木树脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷并采用高效液相色谱法进行含量测定，通过对实验方法的方法学考察，结果表明，该方法专属性强、准确稳定，可为复方鲜竹沥液以及其他含鲜竹沥的复方制剂质量标准研究、质量控制与评价提供实验依据和参考。