非洲猪瘟病毒pI215L 蛋白结构与功能的生物信息学分析

赵金兵，王铁军，王莫离，石建州，姚伦广

（1.南阳师范学院，河南 南阳 473061；2.南阳农业职业学院，河南 南阳 473000）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的猪科动物广泛出血性、高病死率传染病［1］。ASFV 是一种核质大DNA 病毒［2］，病毒粒子的直径260～300 nm，基因组为线性双链DNA，大小为170～194 kb［3］，含有150～167 个开放阅读框［4］。ASFV 基 因 组 编 码 多 种 蛋 白［5］，包 括54 种 结 构 蛋白以及100 多种非结构蛋白［6］。ASFV 结构复杂，呈20 面体对称形态，具有多层结构［7-8］，成熟病毒粒子的基因组依次包裹着内核芯壳、内膜、衣壳和外囊膜［9］。ASFV 基因组编码的蛋白在病毒生命周期调控以及免疫逃逸中发挥着至关重要的作用［10-12］。

ASFV 基因pI215L 编码的泛素结合酶的序列与E2 泛素结合酶的同源性较高。蛋白pI215L 是一种E2 泛素结合酶（ubiqutin-conjugating enzyme，UBC），也是目前已知的唯一由病毒基因编码的UBC。pI215L 蛋白发挥着泛素-蛋白酶体系的核心功能。pI215L 蛋白调控病毒的感染和复制，具生物学活性，在体外实现自泛素化和泛素化组蛋白等重要功能［13］。pI215L 蛋白参与调控宿主细胞蛋白泛素化的机制尚不清晰。该研究对pI215L 进行生物信息学分析，解析蛋白结构和功能，探索其调控ASFV 复制和感染宿主的结构基础及分子机制，也为研发抗ASFV 药物和ASFV 新型减毒疫苗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 pI215L 基因同源性分析

从ASFV 数 据 库 （The African Swine Fever Virus Database，ASFVdb）（http：//asfvdb.popgenetics.net/）下载29 个不同毒株的pI215L 基因序列，使用DNAMAN 6.0 和DNAStar 7.0 软件分析核苷酸序列的同源性及遗传进化关系。

1.2 pI215L 蛋白理化性质预测

利用ExPASy 网站ProtParam 在线软件（http：//web.expasy.org/protparam/）分析pI215L 蛋白的氨基酸组成等理化性质。

1.3 pI215L 蛋白二级结构预测

利 用SOPMA（http：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page =npsa_sop -ma.html）对pI215L 蛋白的二级结构进行在线分析；运用SMART 程序预测pI215L 蛋白的功能结构域。利用在线软件STRING （https：//cn.string-db.org/）分析与pI215L 相互作用的蛋白。

1.4 pI215L 蛋白线性表位预测与三维空间位置

使用DNAStar 7.0 软件的Protean 程序预测pI215L 蛋白的B 细胞抗原表位，分析氨基酸序列，包括亲水性、柔韧性、抗原指数、表面暴露区。运用Kyte-Doolittle 的氨基酸亲水标准进行疏水性预测；根据Karplus-Sohulz 的柔性蛋白预测方案分析柔性区域位；根据Emini 原则预测表面暴露区；根据Jameson-Wolf 抗原指数方案预测B 细胞抗原表位。利用SWISS-MODEL 同源建模，定位抗原表位的三维空间位置。

2 结果与分析

2.1 同源性分析

DNAMAN 分析结果显示，29 个不同ASFV 毒株的一致性是93.25%，分离自中国的5 个ASFV毒株（China_HLJ_2018、China_ASFV-SY18_2018、China_AnhuiXCGQ_2018、China_wbBS01_2018、China_LN_2018）的pI215L 基因核苷酸序列同源性为100%。DNAStar 分析结果显示，不同毒株的pI215L 基因核苷酸序列同源性较高，29 个毒株的pI215L 基因核苷酸序列同源性分析结果见图1，进化树分析结果见图2。

图1 29 种ASFV 毒株pI215L 核苷酸序列同源性比较

2.2 理化性质

通过ExPASy 网站PortParam 在线软件分析pI215L 蛋白的理化性质，结果显示，pI215L 蛋白共有3360 个原子组成，其分子式为C1087H1642N264O358S9，相对分子质量为24 425.09；由212 个氨基酸组成，谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、脯氨酸（Pro）所占比例较高，分别为13.2%、9.4%、8.5%；其中带正电荷的残基（Arg+Lys）总数为19 个，带负电荷的残基（Asp+Glu）总数为48 个；理论等电点（pI）为4.21；在哺乳动物体外网织红细胞中半衰期为30 h，脂肪系数为71.79，不稳定系数为58.16，归类为不稳定蛋白；总平均亲水性（grand average of hydropathicity，GRAVY）为-0.700。

2.3 pI215L 蛋白二级结构、功能结构域分析与蛋白互作关系预测

通过ExPASy 网站的SOPMA 工具对pI215L蛋白氨基酸序列的二级结构进行预测。结果表明，其二级结构主要含有α-螺旋（Hh）、延伸链（Ee）、β-转角（Tt）、无规卷曲（Cc）4 种形式。其中，Hh 有79 个氨基酸，占37.26%；Ee 有37 个氨基酸，占17.45%；Tt 有14 个氨基酸，占6.60%；Cc 有82 个氨基酸，占38.68%（见图3），4 种结构贯穿整条氨基酸链。

图3 pI215L 二级结构分析结果

SMART 分析pI215L 蛋白功能结构域结果见图4，pI215L 蛋白有1 个泛素化结合酶E2（ubiquitin-conjugating enzyme E2）结构域，属于催化结构同系物，位于第4～160 位氨基酸残基处UBCc 结构域。位于第193～212 位氨基酸有1 个低复杂域。

图4 pI215L 蛋白的结构域分析

pI215L 蛋白互作关系预测见图5，pI215L 蛋白与UBE2Q1、UBE2H、UBE2U、UBE2J2 和UBE2G2、UBE2F、UBE2V2、CDC34、UBA1 等蛋白存在相互作用关系。

图5 pI215L 蛋白互作关系预测

2.4 pI215L 线性表位预测结果与表位的三维空间位置

利用DNAStar 的Protean 预测pI215L 的亲水性、柔韧性、抗原指数、表面暴露区，结果见图6。柔性区段主要有第15～22、25～32、38～52 氨基酸等15 处；亲水区主要位于第7～9、12～33、41～50 氨基酸等7 处；B 细胞抗原表位可能有第1～2、12～33、35～46 氨基酸等12 处；表面暴露区主要在第10～11、16～20、26～32 氨基酸等17 处。综合分析同时符合4 个指标（亲水性、柔韧性、抗原指数、表面暴露区）的肽段，预测结果显示，pI215L 蛋白的抗原表 位 的 肽 段 位 共 16 处 ：16ELKSL20、26EGFRITLV32、41WEVAI45、58FKA60、64FPI66、81MW82、92VKISILH98、102DDPQSG107、120VRTILLS126、133EPNTFS138、140ANVDASVM147、15 2RDSKGKDK159、162AEIIRKQ168、180GV181、183 VPTTLAEYCI196、202YDDEDEEEEDD211（见表1）。

表1 Protean 预测的抗原表位

图6 pI215L 蛋白的抗原表位的肽段位的预测

对pI215L 蛋白三级结构进行预测分析，使用SWISS-MODEL 软件同源建模，与PDB 数据库中的6NYO.1（ubiquitin-conjugating enzyme E2 R2 和ubiquitin）的同源性达46.06%，构建pI215L 蛋白三级结构模型。使用PyMOL 软件将预测的pI215L蛋白抗原表位在模型中的分布准确定位，图7 中绿色部分表示氨基酸个数超过5 个的表位，红色部分表示氨基酸个数小于等于5 个的表位。

3 讨论与结论

ASF 是我国当前最为严重的外来猪病，被列为一类动物传染病。虽然该病已流行百年，但人们对ASFV 的蛋白结构与功能、病毒与宿主互作关系、病原致病与机体免疫机制等关键科学问题认识有限。解析ASFV 抗原蛋白结构与功能，绘制ASFV 与宿主的互作网络，为深入研究病毒感染和免疫逃逸机制提供科学理论基础［14］。泛素化是通过酶促反应进行的，泛素与泛素结合酶E2 的活性位点的半胱氨酸残基结合形成硫酯键，泛素连接酶完成泛素由E2-UB 转移至特定底物蛋白的生物过程，是一种可逆的蛋白翻译后修饰，具有调控信号转导、细胞转录、细胞凋亡、细胞周期、抗病毒应答等功能。蛋白酶体介导的蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解，这一途径在调节细胞生存所需的多个基本生物过程中发挥作用。病毒借助泛素化修饰完成免疫逃逸，利用病毒自身编码的泛素连接酶E3 或去泛素化酶实现免疫逃逸，增强病毒的感染力。pI215L 与泛素结合蛋白同源，病毒感染宿主，与细胞40S 核糖体蛋白RPS23 相互作用，pI215L 结合翻译起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E），进而影响哺乳动物雷帕霉素靶蛋 白 （mammalian target protein of rapamycin，mTOR）信号通路，参与病毒DNA 复制与转录［15-16］。pI215L 调节宿主的翻译机制，调控宿主细胞蛋白的表达和亚细胞定位，但发挥作用的功能机制有待于深入研究和探索［17-18］。

生物信息学分析结果显示，29 个不同毒株的同源性分析证实pI215L 的核苷酸序列大概分为欧洲分支和非洲分支，分离自中国的毒株与欧洲分支的亲缘关系较近。pI215L 蛋白是由212 个氨基酸组成，分子量24.4 kDa，等电点4.21，性质不稳定，亲水蛋白。二级结构影响线性B 细胞表位，蛋白亲水性氨基酸含量越高，肽段越柔韧，越容易抗原抗体嵌合［19］。pI215L 蛋白有1 个E2 泛素化结合酶功能结构域，属于催化结构同系物，这与蛋白互作关系预测结果一致，推测pI215L 蛋白与UBE2Q1、UBE2H、UBE2U、UBE2V2、CDC34、UBA1等存在相互作用关系，这些蛋白具有类同的功能。线性表位预测有16 处的肽段是潜在的表位。采用SWISS-MODEL 软件同源建模，与PDB 数据库中的6NYO.1 的同源性达46.06%，利用PyMOL 定位了表位肽段在蛋白三维空间的相对位置。该研究为ASFV 蛋白后续结构解析、功能深入研究、疫苗和药物研制等提供了重要的数据基础。

pI215L 启动干扰泛素机制，调节转录、复制和衣壳化等过程，催化位点Cys85 是ASFV 发挥泛素结合功能和抑制宿主蛋白合成功能的酶的活性位点［15］。UBCv1 蛋白环境耐受性较强，pH 值为4～9，4～42 ℃保持催化能力［20］。在酸性依赖去甲基化或EIPA 抑制前，动态蛋白和网格蛋白介导的细胞进入后，UBCv1 的表达随即开始。UBCv1 在细胞质和细胞核中的弥散分布可能与病毒蛋白和宿主蛋白的泛素化作用有关，感染早期主要分布在细胞核；晚期，在细胞质中也能够检测到，动态穿梭于细胞核和细胞质［18］。鉴定感染细胞可溶性成分存在单泛素化、双泛素化以及多泛素化，产生不同的底物泛素化结构对不同靶标的宿主或病毒蛋白至关重要，表明pI215L 可能参与了多种调控途径。pI215L 是一种非常早期的病毒蛋白，不依赖病毒DNA 复制，与早期表达蛋白CP204L 表达谱相似，在感染晚期逐渐积累。病毒感染早期开始转录，2 h和16 h 出现两个转录高峰，表明pI215L 可能参与病毒转录、基因组复制等不同阶段的病毒生命周期，在感染宿主过程中发挥着重要作用［15］。感染4～20 h 后，pI215L 被招募到“病毒工厂”。pI215L参与病毒的晚期转录，pI215L 下调导致B646L 转录本减少，ASFV 基因组复制、病毒晚期转录和子代产生是通过泛素途径介导的，泛素-蛋白酶体系统在ASFV 感染宿主中发挥着作用［20］。

机体先天免疫是宿主抵抗病毒感染的第一道防线，干扰素（IFN）是先天免疫应答的重要组成成分，ASFV 如何逃逸宿主的先天免疫系统的防御，干扰素与病毒感染关系不明晰。新的研究通过siRNA 降低蛋白pI215L 的表达，ASFV 复制抑制显著，但增强了病毒诱导IFN-β 和ISG56 的生成；通过免疫共沉淀联合质谱检测到和pI215L 互作的E3 泛素连接酶RNF138，pI215L 招募RNF138；促 进RNF138 降 解RNF128，抑 制RNF128 对TBK1 的K63 位泛素化修饰，最终抑制了IFN-β的生成；研究发现pI215L 能够抑制Ⅰ型干扰素的产生，并且显著影响干扰素产生的抑制作用，进而阐明了pI215L 抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制，揭示了ASFV 免疫逃逸的新机制［21］。拮抗干扰素产生的基因与病毒致病力密切相关，如果缺失病毒拮抗IFN 产生的基因将为减毒疫苗的研发提供新思路，是研制ASFV 疫苗的有效策略之一。

综上所述，该研究利用生物信息学分析了ASFV 的基因编码的pI215L 蛋白的进化和同源性、理化性质、结构与功能以及抗原的表位等，可为pI215L 的生物学功能以及病毒相关致病性机制的进一步研究提供必要的数据参考。