柠檬酸和醋酸对小鼠离体肠平滑肌运动的影响

周鑫漪，范 桢，岳家田，刘馨博，赵红琼

（新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

柠檬酸是一种三羧酸类化合物，易溶于水，无气味，品尝时具有很强的酸味，是一种广泛使用的具有增加酸度、增加溶解度、抗氧化等功能的食品添加剂和饲料添加剂［1-2］。天然柠檬酸在自然界中分布较广，存在于柠檬、柑橘、菠萝等植物果实以及动物的骨骼、肌肉、血液中［3］。柠檬酸还可人工合成或用微生物发酵制备。醋酸也称乙酸，是一种有机一元酸，为食醋主要成分，在自然界中主要以酯的形式存在［4］。在动物的组织内、排泄物和血液中以游离酸的形式存在。许多微生物都可以通过发酵将不同的有机物转化为醋酸［5］。醋酸可使pH值降低至低于微生物最适生长所需的pH 值从而发挥抗微生物作用［6］。柠檬酸和醋酸均为常用食品添加剂或饲料添加剂，具有抗菌和抗氧化等功能［7-8］。国内外关于人或动物食用这两种酸后对消化道机能影响的研究相对较少［9-11］。该研究旨在通过探究柠檬酸和醋酸对小鼠离体肠平滑肌运动的影响及可能的机制，为开发具有调控人或动物消化道运动机能障碍的有机酸类产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物

昆明系小白鼠6 只，其中，雄性4 只，雌性2只，雌、雄分笼饲养，平均体重（32±5）g，来源于新疆医科大学动物实验中心。

1.1.2 主要仪器设备

Powerlab 8/30（ML870）八通道生物信号采集系统，桥式放大器 （ML118），配套记录软件为Chart for Windows 5.3，均为澳大利亚ADInstruments 公司产品；张力换能器（MLT0201/RAD），量程5 mg～25 g，西班牙Panlab 公司产品；四通道离体器官浴槽，美国Radnoti 公司产品。

1.1.3 主要试剂

柠檬酸（分子量210.14）、醋酸（分子量60.05，含量99.5%）、碳酸氢钠、无水氯化钙和葡萄糖，均为天津市致远化学试剂有限公司产品；氯化钠为天津市鑫铂特化工有限公司产品；氯贝胆碱（Bethanechol chloride，BCh，分子量169.68，批号MK-BQ9916V）和氯化钾（Potassium chloride，KCl，分子量74.55，批号WX-BC0510V）为Sigma-Aldrich 产品；台氏营养液配方见参考文献［12］，现配现用。

1.2 试验方法

1.2.1 浓度递增柠檬酸和醋酸对小鼠离体肠运动的影响研究

小鼠禁食、不禁水12 h 后，颈部脱臼处死，迅速剖腹取出小肠段，放入室温台氏营养液中，截成1.5 cm 左右肠段，一端固定到盛有10 mL 台氏营养液的离体器官浴槽底部挂钩，另一端固定到张力换能器上，肠段给予1 g 负重。离体器官浴槽循环水浴温度设置为37 ℃，用泵往台氏营养液通入适量空气。检测浴槽台氏营养液中2 倍浓度递增柠檬酸 （0.02～0.64 mmol/L）和醋酸 （0.13～2.00 mmol/L）对小鼠离体肠运动的影响。用药前描记收缩曲线1 min，每次累积给药后记录3 min 收缩曲线，最后用台氏营养液冲洗浴槽及肠段3 次，每次冲洗间隔1 min，待肠段恢复运动后继续下一个试验。该研究每种处理均设置6 个重复。用Chart for Windows 5.3 软件计算肠段收缩幅度和收缩张力，分别对应软件“周期测量”中的“平均幅值”和“平均最小值”。

1.2.2 一次性有效浓度柠檬酸或醋酸对小鼠离体肠运动影响研究

通过浓度递增试验，推测柠檬酸和醋酸抑制小鼠离体肠运动的有效浓度（小肠收缩活动完全抑制前一梯度药物浓度）分别为0.32 mmol/L（=67 mg/L）和1.00 mmol/L（=60 mg/L），检测用药后3 min 以及清洗后小鼠离体肠段收缩幅度和收缩张力的变化。

1.2.3 柠檬酸或醋酸对KCl 和BCh 引起小鼠离体肠段收缩影响研究

将柠檬酸或醋酸与KCl 或毒蕈碱型受体（muscarinic receptor，M-受体）激动剂BCh 联合使用，初步探索柠檬酸或醋酸抑制肠段运动的可能机制。用药前描记肠段收缩曲线1 min，然后加入有效浓度的柠檬酸、醋酸或等体积水（空白对照），记录描记曲线1 min，再向台氏营养液中加入终浓度为25 mmol/L KCl 或3×10-5mol/L BCh，记录描记曲线2 min 后清洗肠段，比较KCl 用药后峰值（为Chart for Windows 5.3 软件中 “周期测量”的“最大值”）变化、BCh 用药后收缩幅度和收缩张力的变化。

1.2.4 数据统计

计算每次用药后指标除以用药前相应指标的百分比，然后用“平均值±标准误（SEM）”的形式表示。用SPSS 24.0 统计学软件进行LSD 的单因素方差分析，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 浓度递增的柠檬酸和醋酸对小鼠离体肠段运动的影响

检测了2 倍浓度递增 （0.02～0.64 mmol/L）柠檬酸对小鼠离体肠段运动的影响。收缩曲线显示（见图1A），随着柠檬酸浓度递增，用药后肠段收缩力递减，浓度达到0.64 mmol/L 后完全抑制。每次用药后3 min 内统计结果显示（见图1B），柠檬酸浓度达0.16 mmol/L 时收缩幅度较用药前显著（P＜0.05）减小，浓度达0.32 mmol/L 和0.64 mmol/L时收缩幅度极显著（P＜0.01）低于用药前，分别为用药前的（49±8）%和（11±2）%；用药浓度达0.32 mmol/L 和0.64 mmol/L 时收缩张力分别显著 （P＜0.05）和极显著（P＜0.01）低于用药前，分别为用药前的（82±3）%和（79±5）%。

收缩曲线显示（见图2A），随着醋酸浓度递增（0.13～2.00 mmol/L），用药后肠段收缩力递减，浓度达到2.00 mmol/L 后完全抑制。每次用药后3 min 内统计结果显示（见图2B），醋酸浓度达2.00 mmol/L 时，收缩幅度极显著（P＜0.01）低于用药前，为用药前的（16±3）%；醋酸浓度达1.00 mmol/L 和2.00 mmol/L 时，收缩张力均极显著（P＜0.01）低于用药前，分别为用药前的（82±3）%和（76±5）%。

图2 浓度递增的醋酸对小鼠离体肠段运动的影响

2.2 一次性有效浓度柠檬酸或醋酸对小鼠离体肠段运动的影响

该试验研究了能够抑制离体肠段收缩幅度的0.32 mmol/L（有效抑制浓度）柠檬酸或1.00 mmol/L（有效抑制浓度）醋酸对小鼠离体肠运动的影响。肠收缩曲线显示（见图3A、图3B），一次性有效浓度柠檬酸或醋酸使肠段收缩力明显减小，在3 次用营养液清洗后收缩力基本恢复到用药前。用药后3 min 内统计结果显示（见图3C、图3D），柠檬酸或醋酸使肠段收缩幅度同用药前比较均极显著（P＜0.01）减小，分别为用药前的（41±5）%和（39±6）%；而收缩张力变化均不显著（P＞0.05）；清洗3次后，肠段收缩幅度和收缩张力同用药前比较差异均不显著（P＞0.05）。

图3 一次性有效浓度柠檬酸或醋酸对小鼠离体肠段运动的影响

2.3 柠檬酸或醋酸与KCl 联合用药对小鼠离体肠段运动的影响

该研究探索了柠檬酸或醋酸与KCl 联合用药对小鼠离体肠段运动的影响。收缩曲线显示（见图4A），柠檬酸或醋酸用药后肠段收缩力均减弱，而加等体积水不影响肠段收缩，但2 种酸分别与KCl 联合用药后收缩曲线均出现陡峭波峰。KCl 用药后峰值统计结果显示（见图4B），3 个处理间峰值差异不显著（P＞0.05）。

图4 柠檬酸或醋酸与KCl 联合用药对小鼠离体肠段运动的影响

2.4 柠檬酸或醋酸与BCh 联合用药对小鼠离体肠段运动的影响

该研究探索了柠檬酸或醋酸与M-受体激动剂BCh 联合用药对小鼠离体肠段运动的影响。收缩曲线显示（见图5A），柠檬酸、醋酸或水与BCh联合用药后，肠段均出现紧张性收缩。联合用药后2 min 内统计结果显示（见图5B），柠檬酸+BCh 联合用药后较水+BCh 联合用药收缩幅度显著 （P＜0.05）增强，柠檬酸或醋酸+BCh 用药后收缩张力与水+BCh 联合用药相比无显著（P＞0.05）差异。

图5 柠檬酸或醋酸与BCh 联合用药对小鼠离体肠段运动的影响

3 讨论

该研究结果表明，2 倍浓度递增的柠檬酸和醋酸均剂量依赖性地抑制小鼠离体肠段收缩运动。袁梦等［9］报道，0.1 g/L 和0.15 g/L 柠檬酸可提高小鼠与家兔离体肠段活动力（收缩强度×收缩频率）（P＜0.01），这一结果似乎与该研究结果相反。但值得注意的是，在平滑肌被抑制时，记录软件在计算收缩频率时会将由于电流或系统干扰的非常小的波计算在内，而从数据上看收缩频率增加，导致收缩活动力增加。因此，在检测具有抑制平滑肌运动药物时，需要在软件系统人为设定采集的最小波，不宜将干扰波采集到数据中。刘俊栋等［10］报道，8～35 mmol/L 乙酸能抑制牛真胃平滑肌的收缩强度（P＜0.01），而40～50 mmol/L 乙酸能增大真胃平滑肌的收缩强度（P＜0.05），可见药物使用剂量、动物种类、采集平滑肌部位不同，均可能影响药物对平滑肌的收缩作用。

柠檬酸和醋酸均为有机酸，前者分子中有3个羧基，后者分子中有1 个羧基，柠檬酸分子量约为醋酸的3 倍。该研究发现，柠檬酸和醋酸对离体肠段收缩有效抑制浓度分别为0.32 mmol/L 和1.00 mmol/L，即醋酸有效抑制浓度约为柠檬酸的3倍，提示这两种有机酸对离体肠段的抑制作用，可能以羧基为主要功能单位。

KCl 促进离体肠的兴奋作用是基于其引起平滑肌细胞膜去极化，而导致细胞膜上Ca2+电压门控通道打开，细胞外Ca2+内流，而使平滑肌快速收缩［13-14］。在该研究中，无论是柠檬酸还是醋酸用药后，并未影响KCl 引起的肠段收缩峰值，提示这两种有机酸不能影响平滑肌细胞的去极化。消化道平滑肌的运动受到外来神经和壁内神经丛的调节。外来神经中的副交感神经节前纤维与壁内神经元形成突触，然后发出节后纤维支配平滑肌细胞的运动。大部分节后纤维释放乙酰胆碱，通过激活毒蕈碱型受体（muscarinic receptor，M-受体），促进消化道的运动及影响其他功能［15］。在该研究中，柠檬酸或醋酸用药后，并未影响M-受体激动剂BCh 对肠段收缩张力的提高，但柠檬酸用药后使BCh 对肠段收缩幅度减小得到缓解，提示柠檬酸对离体肠段的痉挛具有缓解作用，且可能部分通过抑制M-受体实现。柠檬酸和醋酸对离体肠段抑制作用的机制有待进一步研究，例如是否调节胃肠道Cajal 间质细胞功能而调节收缩活动［16］。

在动物生产实践中，柠檬酸或醋酸及衍生物被广泛用作饲料添加剂。黄兴海［7］报道，添加0.4%柠檬酸能有效促进草鱼的生长。李亦汉等［17］认为，用两歧双歧杆菌灌胃小鼠可升高消化道中醋酸水平，进而可缓解由于炎症引起的便秘的症状。曹山川等［18］研究表明，将柠檬酸添加到基础日粮中可影响消化道菌群数量并影响消化性能。但是，在使用柠檬酸和醋酸作为添加剂时，需要注意使用剂量，该研究结果显示，如果剂量太高，可能会抑制消化道运动。也有报道醋酸可损伤大鼠肠黏膜［19-20］。

4 结论

柠檬酸和醋酸均剂量依赖性地抑制小鼠离体平滑肌的运动，有效抑制浓度分别为0.32 mmol/L和1.0 mmol/L，且柠檬酸和醋酸可能并不影响平滑肌细胞膜的去极化过程，但柠檬酸可能部分影响M-受体的作用而对消化道平滑肌具有解痉作用。该研究结果为人类或兽医临床利用有机酸干预消化道运动机能障碍相关疾病提供了参考。