mPEG链长及分散性对mPEG-TPE胶束行为影响

郝祖杭 袁于民

摘 要： 為研究聚乙二醇单甲醚（mPEG）链长及分散性对其胶束的理化性质及不同介质下稳定性的影响，采用具有聚集发光特性的四苯乙烯（Tetraphenylethylene，TPE）为憎水段，合成了3种不同链长的单分散mPEGn-TPE酯（n=15，23，35），以及1种多分散mPEG1000-TPE酯的双亲分子。探讨了mPEG链长及分散性的差异对mPEG-TPE胶束的临界胶束浓度（Critical micelle concentration，CMC）、粒径、荧光强度、水解速度及在牛血清白蛋白（BSA）溶液中稳定性的影响。结果表明：所合成4种mPEG-TPE化合物均在水溶液中形成自组装胶束并展现出AIE特征，胶束的尺寸、CMC值及在磷酸盐缓冲液（PBS）中的水解速度，随着PEG链长的增长而增加，但荧光强度减弱，这说明胶束内核TPE之间的相互作用减弱；在BSA介质下，保持胶束稳定的时间随PEG链增长而增加，与mPEG1000-TPE胶束对比，分子量相当的单分散mPEG₂₃-TPE胶束在BSA溶液中能保持更长时间的稳定，展示了单分散的优势。因此，纳米载体系统在临床应用时很有必要采用单分散的PEG，以获得更好的药物递送效果。

关键词：单分散聚乙二醇；四苯乙烯；聚集诱导发光；胶束；粒径；抗蛋白吸附

中图分类号：TQ432.2

文献标志码：A

文章编号：1673-3851 （2023） 05-0365-09

引文格式：郝祖杭，袁于民. mPEG链长及分散性对mPEG-TPE胶束行为影响［J］. 浙江理工大学学报（自然科学），2023，49（3）：365-373.

Reference Format： HAO  Zuhang，YUAN  Yumin. Effects of the chain length and dispersity of mPEG on mPEG-TPE micelle behavior［J］. Journal of Zhejiang Sci-Tech University，2023，49（3）：365-373.

Effects of the chain length and dispersity of mPEG on mPEG-TPE micelle behavior

HAO Zuhang^1a，1b， YUAN Yumin^1a，1b，2

（1a.School of Materials Science & Engineering; 1b.Institute of Smart Biomedical Materials， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China; 2. Biomatrik Inc.， Jiaxing 314001， China）

Abstract： To provide a greater insight to the effects of the chain length and dispersity of methoxy polyethylene glycol （mPEG） on its physicochemical properties and stability in different media， we used tetraphenylethylene （TPE） with aggregated luminescence characteristics as the hydrophobic segment， synthesizing three monodisperse mPEGn-TPE esters with different chain lengths （n=15， 23， 35） and one polydisperse counterpart mPEG1000-TPE. We discussed the effects of the differences of mPEG chain length and dispersity on the critical micelle concentration （CMC）， particle size， fluorescence intensity， hydrolysis rate and stability in bovine serum albumin （BSA） solution of mPEG-TPE micelles. Results indicate that the four mPEG-TPE compounds synthesized all formed self-assembled micelles in aqueous solution and showed AIE characteristics. The size of micelles， CMC value and hydrolysis rate in phosphate buffer solution （PBS） increased with the increase of PEG chain length， while the fluorescence intensity decreased， which indicated that the interaction between TPE in micelle core weakened. In BSA medium， the time to keep the micelle stable increases with the increase of PEG chain. Monodisperse mPEG₂₃-TPE has a much better stability than its polydisperse mPEG1000-TPE counterpart in BSA solution， suggesting that monodispersity of PEG could be a preferred choice when a nano-formulation is to be developed for a drug delivery application.

Key words：monodisperse PEG; tetraphenyl ethylene; AIE; micelles; partical size; resistance protein adsorption

0 引 言

自组装纳米结构，如胶束^［1-2］、囊泡^［3-4］、脂质体^［5］以及纳米粒子^［6］等在药物递送、基因递送、成像、疫苗等生物医药领域有着广泛应用^［7-9］。聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）是两亲性化合物中最常用的水溶性嵌段，与憎水段通过自组装形成的胶束被认为是一类非常有前途的药物载体。PEG纳米载体克服了疏水药物水溶性差的问题，还能在胶束的外层形成生物惰性的mPEG冠，减少胶束与蛋白质的相互作用^［10］。胶束与蛋白质的相互作用可直接决定胶束在体内的循环半衰期，如蛋白质吸附可导致胶束在循环过程中或肝脏、脾脏等组织中被网状内皮系统（Reticuloendothelial system，RES）的巨噬细胞渗透和吞噬，进而影响药物载体的性能^［11-12］；吸附了蛋白质的胶束更容易解体，无法承担药物递送的任务。因此，减少胶束表面蛋白质的吸附，有助于延长胶束的血液循环半衰期。

PEG的分子量与蛋白质吸附有直接的关系，在达到一定分子量的门槛前，分子量越小，载体吸附蛋白的量越大^［13］。目前多数PEG为多分散性的，由分子量大小不一的PEG链段组成；分子量小的部分决定了蛋白质吸附程度，是多分散性PEG的一个关键缺陷^［14］。

聚集诱导发光（Aggregation-induced emission，AIE）化合物是一类具备特殊的分子内旋转受限机理的有机染料，能够在聚集状态下（水中或固态）发射荧光，并且其荧光强度随聚集状态的增强而提高，因此含AIE分子的胶束可通过荧光强度来检测胶束的聚集状态^［15］。在所有的AIE分子中，四苯乙烯（Tetraphenylethylene，TPE）是最经典也是使用最广泛的聚集诱导发光化合物。Wu等^［16］将TPE与传统有机染料共价连接在同一线性PEG的一侧，通过检测不同波长的荧光强度比值，实现了对胶束聚集状态的实时检测；聚集诱导发光化合物作为疏水段被引入至mPEG链的一端，以通过AIE效应产生的荧光强度评价mPEG-TPE胶束中mPEG长度及分散度对胶束聚集状态的影响。

本文使用不同链长及分散性的mPEG合成了3种不同链长的单分散mPEGn-TPE（P15、P23、P35），以及1种多分散mPEG1000-TPE（P1k）。测定了4种mPEG-TPE胶束在CMC、粒径、荧光强度、水解速度及在牛血清白蛋白（BSA）溶液中稳定性差异，分析了mPEG链长及分散性对mPEG-TPE胶束的理化性质影响。本文为单分散mPEG胶束的在生物医药领域的应用提供了参考。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料

单分散聚乙二醇甲醚乙酸（mPEGn-CH₂COOH，n=15，23，35）及多分散聚乙二醇甲醚乙酸（mPEG1000-CH₂COOH）由浙江博美生物技術有限公司提供；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐（EDCI）购自苏州昊帆生物股份有限公司；4-二甲氨基吡啶（DMAP）购自上海共价化学科技有限公司；二苯甲酮、四氯化钛（TiCl₄）、4-羟基二苯甲酮、锌粉（Zn）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；石油醚（PE）、乙酸乙酯（EA）、二氯甲烷（DCM）购自杭州双林化工试剂有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS）购自北京沃凯生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）购自北京索莱宝科技有限公司。所有药品使用前未经纯化。

1.1.2 实验仪器

液相色谱仪（HPLC，UltiMate3000，赛默飞世尔科技公司）；核磁共振氢谱仪（¹H NMR，600 MHz，布鲁克公司）；基质辅助激光解析飞行时间质谱仪（MALDI-TOF，rapifleX，布鲁克公司）；表面张力仪（OT-60，宁波新边界科学仪器有限公司）；纳米粒度及Zeta电位分析仪（Be Nano 180 Zeta Pro，丹东百特仪器有限公司）；稳态/瞬态荧光光谱仪（FLS1000，英国爱丁堡公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 mPEG-TPE的合成

羟基-四苯乙烯（TPE-OH）按照文献^［17］的方法合成，具体过程如下：称取二苯甲酮（36.4 g，0.2 mol）、4-羟基二苯甲酮（40.4 g，0.2 mol）与锌粉（32.5 g，0.5 mol），加至2 L反应瓶中，再将1 L THF加入反应瓶中，置于冰水浴下保持搅拌，在氩气保护下，将四氯化钛（45.5 g，0.24 mol）缓慢滴加至反应液中，滴加完毕后，升温至70 ℃，回流反应12 h，得到黑色悬浊液。通过薄层色谱（TLC）监测反应，反应结束后，反应液浓缩并通过柱层析纯化（PE→PE∶EA=20∶1）后得到淡黄色固体。柱层析纯化采用的洗脱液为PE与EA组成的混合溶液，其中PE与 EA 的体积比为20∶1。将淡黄色固体加入到混合溶剂（EA∶PE=EA和PE的体积比为2∶3）中打浆后得到8.5 g白色粉末状TPE-OH，产率为49%，质谱的实测分子量（348.1 Da）与其计算值相符，合成方法如图1（a）所示。

mPEGn-TPE的合成方法如图1（b）所示，以mPEG₁₅-TPE （P15）的合成为例：mPEG₁₅-CH₂COOH（1 g，1.33 mmol）与TPE-OH（463 mg，1.33 mmol）加入100 mL含搅拌子的圆底烧瓶中，然后加入20 mL DCM，搅拌，再依次加入DMAP（32 mg，0.266 mmol）与EDCI（281 mg，1.46 mmol），置于室温下反应8 h。反应液减压浓缩后加入混合溶剂（EA∶PE=EA和PE的体积比为1∶1）中并置于-20 ℃重结晶，得到白色粉末状mPEG₁₅-TPE（P15，1.2 g，产率83%），常温下为淡黄色油状液体。通过同样的方法合成了mPEG₂₃-TPE（P23，0.83 g，产率81%）、mPEG₃₅-TPE（P35，0.83 g，产率86%）及mPEG1000-TPE（多分散，P1k，2.3 g，产率87%）。

1.2.2 高效液相色谱（HPLC）分析

分别称取mPEG-TPE 10 mg，加入1 mL 色谱纯乙腈中，配制为10 mg/mL溶液，经过0.45 μm滤膜过滤后，进行HPLC分析。采用Inertsil ODS-3 5 μm色谱柱，流动相流速为1 mL/min，色谱柱柱温度40 ℃。

1.2.3 分子量表征

采用rapifleX型MALDI-TOF对P15、P23、P35、P1k的质谱进行表征，乙腈作为流动相，基质选择反式-2-［3-（4-叔丁基苯基）-2-甲基-2-亚丙烯基］（DCTB），质谱扫描范围为m/z=500～2500。

1.2.4 核磁氢谱（¹H NMR）表征

以四甲基硅烷（TMS）为内标的氘代二甲基亚砜（d6-DMSO）为溶剂，对样品进行¹H NMR谱分析。

1.2.5 临界胶束浓度测试

采用表面张力法测定胶束的CMC值。用超纯水配制浓度为1 mmol/L的P15、P23、P35、P1k等4种标准液，分别稀释至500、250、100、50、25、10 μmol/L和5 μmol/L。使用表面张力仪测量4种化合物在一系列浓度梯度下的表面张力值，绘制表面张力与浓度的关系曲线图，两线交点即为化合物的CMC值。

1.2.6 粒径分布测试

分别配制浓度为1 mmol/L 的P15、P23、P35、P1k溶液，超声震荡30 min后，通过亲水性0.45 μm滤膜过滤去除气泡，测量4种胶束溶液的粒径及其分布。

1.2.7 荧光强度测试

分别配制浓度为1 mmol/L 的P15、P23、P35、P1k溶液，测试其荧光强度。荧光激发波长设置为370 nm；荧光发射波长扫描范围为380～700 nm。

1.2.8 水解稳定性测试

称取P15、P23、P35、P1k各20 mg分别溶解于PBS中搅拌，在特定的时间点（0 、24、48、72、96、120、144 h和168 h）下取100 μL溶液，加至900 μL乙腈中，经0.45 μm滤膜过滤，进行HPLC分析，计算出剩余化合物百分比，绘制稳定性曲线图。HPLC分析方法为：体积分数为0.1%的TFA乙腈溶液作流动相B、体积分数为0.1%的TFA水溶液作流动相A。0～13 min，流动相B由50%线性下降至40%；13～19 min由40%线性下降至10%，19.01 min，流动相B回至50%，并保持直至23 min结束。

1.2.9 抗蛋白吸附测试

P15、P23、P35、P1k加入PBS中，分别配制成浓度为1 mmol/L的胶束溶液，超声震荡30 min后与等量的1 mg/mL BSA溶液混合。用親水性0.45 μm滤膜过滤去除混合溶液中的气泡，分别在0、1、2、3 、4、5 h和6 h测量4种胶束与蛋白质混合液的粒度分布。

2 结果与讨论

2.1 纯度及结构表征

2.1.1 高效液相色谱分析

对合成的4种mPEG-TPE产物用HPLC进行纯度分析，结果显示其纯度均在98%以上，因此可对其进行进一步表征与胶束行为研究。图2为4种mPEG-TPE的HPLC谱图合并图。由图2可知，单分散的P15、P23及P35的主峰均为尖锐且很窄的单峰；而多分散的P1k的主峰为宽而钝，其保留时间几乎覆盖了从P15至P35的保留时间，揭示了多分散P1k中混有分子量不等的mPEG-TPE组份。在单分散mPEGn-TPE的HPLC谱图中，链长或重复单元数n影响其在色谱上的保留时间。

通过对P15、P23及P35的保留时间与PEG链长作图并进行线性拟合分析，发现 n越大，保留时间越短，二者存在线性关系为0.995，说明由散点拟合曲线与散点的相关性很好（见图3），通过测定未知n的mPEGn-TPE的保留时间，根据图3线性关系，可推算n值。

2.1.2 质谱分析

P15、P23、P35、P1k的实测分子量通过MALDI-TOF质谱获得，结果如图4所示。由图4（a）可知，P15出现了3个分子离子峰，分别对应［M+H］+、［M+Na］+与［M+K］+；P23、P35中出现两个离子峰，对应［M+Na］+与［M+K］+；P15中强度最高的质荷比为1119.52，对应［M+K］+，与理论分子量1119.48相符合。P23、P35中最强质荷比分别为1455.75、1984.08，正好与各自的［M+Na］+对应，证明P15、P23、P35的成功合成。图4（b）表明：P1k由于多分散的原因，其质量呈现以1324.67为中心的多分散态，与P1k中聚合度为20的片段［P20+Na］+的计算分子量1324.58一致。由于其在质谱上主要呈现［M+Na］+与［M+K］+两种状态，相邻两峰间的质荷比差值分别为28与16，对应［M-1+K］+与［M+Na］+的分子量差与［M+Na］+与［M+K］+的分子量差，因此同种离子状态与其前体离子之间质荷比差为44，也即分子量之差为44 Da，为一个PEG单元（CH₂CH₂O）的分子量，证实P1k的成功合成。

2.1.3 核磁氢谱分析

TPE-OH的核磁共振氢谱图如图5（a）所示，其中化学位移为9.35/10⁶的信号峰对应于羟基分子上的H^a原子。化学位移为（6.64～6.54）/10⁶、（6.70～6.77）/10⁶、（6.88～7.07）/10⁶和（7.02～7.19）/10⁶上的4个信号峰分别对应苯环上的氢原子H^b、H^c、H^d和H^e，当以羟基上的氢原子特征峰计为峰面积是1的基准峰时，每种特征峰的峰面积与其分子中的氢原子个数对应。mPEG-TPE的化学结构同样经¹H NMR谱图分析图5（b）所示。

图5（b）显示：P15、P23、P35和P1k的核磁共振氢谱图中（3.41～3.67）/10⁶的信号峰对应聚乙二醇上的氢原子H^b，而化学位移为（6.93～7.17）/10⁶的信号峰对应四苯乙烯上的氢原子H^d；当以聚乙二醇中一端甲氧基上的氢原子H^a特征峰记为面积是3的基准峰时，P15、P23、P35和P1k中四苯基乙烯特征峰的峰面积均为19，与四苯乙烯上的氢原子数对应，而聚乙二醇的特征峰面积则与其各自聚乙二醇链上的氢原子个数对应，证明4种单甲醚聚乙二醇乙酸成功修饰四苯乙烯。

2.2 临界胶束浓度

临界胶束浓度是表征胶束热力学稳定性的重要参数，形成胶束的能力越强，则CMC越小，胶束的热力学稳定性越高^［18］。为分析PEG链长及分散性对胶束CMC的影响，本文通过悬滴法测定了这4种mPEG-TPE在不同浓度下的表面张力值，根据表面张力值拐点获得4种mPEG-TPE的CMC值，结果如图6所示。图6表明：在单分散mPEG-TPE中，P15、P23及P35的CMC分别为11.6、12.2 μmol/L和15.4 μmol/L。随着聚乙二醇链长增加，mPEGn-TPE更倾向于溶解在水中，因此在水溶液中需要更高的浓度达到CMC^［19］；而多分散P1k的CMC值为12.0 μmol/L，与分子量相同的单分散P23并无太大差别，证明分散性对于mPEG-TPE的临界胶束浓度的影响较小，或者是表面张力法对揭示胶束的聚集状况不够灵敏。

2.3 粒 径

图7为不同链长的mPEG-TPE胶束在水溶液中的粒径及粒径分布的测试结果。由图7可知，P15、P23、P35胶束的粒径分别为8.4、9.1 nm和10.2 nm，胶束粒径随PEG链长的增加而增大，与预期的结果相符；在疏水段均为TPE时，亲水段PEG链长的增加，使得整个分子的亲水憎水平衡值（HLB）值向亲水方向移动，更倾向于胶束解聚，导致粒径变大，但影响并不显著；多分散P1k胶束粒径为9.1 nm，与同等链长的单分散P23胶束粒径与粒径分布（PDI）一致，表明mPEG的分散性对链长相当的mPEG-TPE胶束粒径及粒径分布影响甚微。这4种样品的粒径分布系数均小于0.1，分布较为均匀。

2.4 荧光强度

利用TPE聚集发光和mPEG-TPE在水溶液中自组装形成胶束的特性，在相同的AIE组份的摩尔浓度下，通过测定mPEG的链长与分散度对TPE内核聚集发光强度的影响，以进一步揭示TPE聚集行为的变化^{［16，20］}。图8是浓度为1 mmol/L下4种mPEG-TPE胶束在水溶液中的荧光强度对比。图8显示：随着mPEG链长的增加，3种（由P15到P23再到P35的荧光强度逐渐下降，表明胶束内核TPE的聚集程度随之逐渐减弱，与CMC、粒径结果所呈现的趋势一致，即在TPE物质的量固定的前提下，mPEG链增长，mPEG-TPE更倾向溶解于水中，粒径变大，同时TPE的聚集减弱，CMC变大，荧光也减弱；而多分散的P1k分子量与P23相当，但荧光强度小于P23，介于其与P15之间，其原因是P1k中存在部分链短的mPEG（分子量小于1000）参与形成的胶束内，TPE的聚集程度比单分散P23胶束内TPE聚集更加紧密，导致更高的荧光强度。在CMC及粒径的测定过程中，多分散与单分散mPEG-TPE胶束聚集状态的差异难以区分，但分散度导致的胶束内核TPE集聚的微小差别，通过其聚集发光效应产生的荧光信号能轻松区别，较传统CMC方法，这种方法能有效区别不同胶束内核聚集状态的差异，具有更高的灵敏度^［21］。

2.5 水解稳定性

mPEG-TPE的乙酸酯键在水溶液中发生水解从而导致胶束解体^［22］。4种mPEG-TPE胶束在PBS溶液中的稳定性如图9所示。由图9可知，在37 ℃的PBS中搅拌168 h后，亲水段最短的P15残留量最高，为66%，代表其稳定性最高；其次是P23，残留量为47%；穩定性最差的为亲水段最长的P35，剩余43%；多分散P1k的稳定性介于P15与P23之间，剩余60%。根据水解曲线比较可得其总体抗水解稳定性的大小依次为：P15、P1k、P23、P35，与上述CMC与荧光强度的结果保持一致。

2.6 抗蛋白吸附

4种mPEG-TPE胶束与BSA水溶液共同孵育，测定链长与分散度对胶束稳定性的影响，结果如图10所示。图10表明：单分散P15胶束的粒径在孵育1h内显著增大，而单分散的P23、P35胶束的粒径则分别在2 h和3 h后才发生显著增大，胶束粒径变大跟BSA在其表面的吸附有关，随着更多的BSA附着，导致自身胶束的粒径变大，通过BSA融合，使得粒径进一步变大；链长更长的聚乙二醇胶束具有更强的抵御蛋白吸附能力；多分散P1k与单分散P23的PEG链长相当，但其胶束在BSA溶液中的稳定性（介于1～2 h）低于P23胶束（介于2～3 h），部分链短的mPEG-TPE无法在胶束表面起保护作用，难以抵御BSA的吸附，因此胶束粒径的稳定性实际上受制于链短部分。因胶束表面具有均匀的链长，单分散mPEG克服了多分散PEG胶束存在短链部分不足以保护其表面的缺陷。纳米载体表面抵御蛋白吸附的能力与纳米载体在体内半衰期存在着很大的关联^［23-25］，因此，使用单分散PEG的纳米制剂，有助于延长药物在体内的半衰期，从而达到更好的疗效。

3 結 论

本文通过合成3种不同链长的单分散mPEGn-TPE（P15、P23、P35）与1种多分散mPEG1000-TPE（P1k），分析了聚乙二醇链长及分散性对mPEG-TPE胶束的理化性质影响，主要结论如下：

a）在单分散P15、P23、P35胶束中，PEG链增长，胶束内核TPE集聚趋于松散、胶束的CMC增大，热力学稳定性降低，水解速度加快，胶束在BSA水溶液中的粒径稳定性随着链长的增加而明显增强。

b）与链长接近的多分散P1k胶束相比，单分散P23胶束在理化性质方面与P1k差异不明显，在抵御BSA吸附方面有明显的优势。

目前纳米医学领域中相关研究与应用均采用多分散mPEG，然而根据本文研究，单分散mPEG抗蛋白质吸附能力更优，因此，在开发高端纳米制剂中有必要使用单分散mPEG，从而获得更好的临床效果。

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（責任编辑：廖乾生）