雌激素对乳腺癌干细胞增殖、自我更新的作用研究

周勤梅，王 竞，喻允伶△

（1. 重庆市铜梁区人民医院，重庆 402560； 2. 重庆医科大学基础医学院，重庆 400016）

据最新统计，乳腺癌已成为全球女性第一大癌症［1］，发病率和死亡率均较高。乳腺癌发生与环境、激素、表观遗传、基因突变、生活方式等多种因素相关。目前，针对乳腺癌的主要治疗手段有手术切除及辅助放射治疗和化学药物治疗（简称放化疗）等。尽管在乳腺癌治疗方面已取得很大进展，但仍有20%～30%的复发/ 转移率［2-3］。因此，继续深入研究乳腺癌复发、转移、耐药的分子机制，寻求乳腺癌早期诊断及治疗新靶点具有重要意义。乳腺癌干细胞（BCSC）是相对于乳腺癌细胞的独立细胞亚群，具有典型的自我更新能力，且可特异性与乳腺癌细胞表面抗原结合。本研究团队前期研究发现，雌激素可促进人乳腺癌细胞MCF-7增殖及MCF - 7 可诱导干细胞表达，但具体机制尚未明晰。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路是哺乳动物肿瘤免疫中重要的信号通路，在70%恶性肿瘤的癌变过程中发挥了极重要的作用［4-6］。本研究中验证了MCF 细胞具有乳腺癌干细胞特性，探讨不同浓度雌激素对BCSC 的增殖和自我更新作用机制，以为雌激素用于乳腺癌的临床治疗提供实验数据和新的思考策略。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与细胞

仪器：CX23 型荧光显微镜（日本Olympus 公司）；FLX800 型酶标仪（BioTek 公司）；SpectraMax M5 型荧光定量梯度聚合酶链式反应仪（美国MD公司）。

试剂：雌二醇（批号为E8875-1G），聚甲基丙烯酸-2 - 羟乙酯（Poly - HEMA，批号为P3932 - 10G），均购自美国Sigma 公司；DMEM/ F12 培养基（批号为31331093），人白细胞抗原B27（批号为A1486701）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，批号为13256 - 029）、表皮生长因子（批号为RP-8661），均购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；牛血清白蛋白（BSA，批号为A8010），胰岛素（批号为I8830），均购自北京索莱宝科技有限公司；Anti - CD44 抗体（批号为ab189524），Anti -CD24抗体（批号为ab202073），均购自Abcam公司。

细胞：MCF 细胞系（中国科学院细胞库，编号SCSP-531）。

1.2 方法

1.2.1 BCSC 的培养

取Poly-HEMA 1.2 g，加入95%乙醇，置10 mL 容量瓶，定容，37 ℃摇床溶解过夜，经0.22 µm 过滤器滤过，制成体积分数为1.2%的Poly - HEMA；取适量，铺6孔板，每孔1 mL，超净工作台放置过夜；使用前以磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗不少于2 遍；每孔加入1 × 104个MCF - 7 细胞，并加入BCSC 培养基（组成：100 mL DMEM / F12 培养基中加入2 mL 人白细胞抗原B27、2 µg bFGF、20 µg EGF、0.4 g BSA、500 µg 胰岛素和100µL肝素2 mL）培养。

1.2.2 细胞免疫荧光实验

收集上述培养液中悬浮的BCSC（第2代），使用胰蛋白酶消化，置1 mL离心管中，PBS浸洗3 min，1 000 r/min离心5 min，平行3 次；用4%多聚甲醛固定BCSC，室温过夜，0.5%Triton X-100（以PBS 配制）室温通透20 min，PBS 浸洗3 min，1 000 r/min 离心5 min，平行3 次，吸干PBS。在离心管内加入正常山羊血清，室温封闭30 min，1 000 r/ min 离心5 min，加入一抗，4 ℃孵育过夜，PBS浸洗细胞3 min，1 000 r/min 离心5 min，平行3次，吸干多余液体后滴加荧光二抗（CD24/CD44），暗处孵育1 h；PBS浸洗3 min，1 000 r/min离心5 min，浸洗3 次后，滴加DAPI 染核，避光孵育5 min，PBS浸洗3 min，1 000 r/min离心5 min，平行3 次，吸干多余液体；用含抗荧光淬灭剂的封片液重悬细胞并封片，置荧光显微镜下观察并采集图像。

1.2.3 BCSC 的生长

采用CCK-8法。将BCSC以1×105/孔密度接种于96 孔板中，每孔分别加入含0，1，5，10，20，100 nmol/L雌激素的完全培养基培养。细胞贴壁后，分别于0，24，48，72 h 时以CCK - 8 试剂孵育1 h。采用酶标仪检测450 nm 波长处的吸光度（OD）值，并对数据进行分析。

1.2.4 BCSC 的自我更新

采用Mammosphere形成实验将BCSC以1×105/孔密度接种于96孔板中，加入含0，10，20 nmol/L 雌激素的完全培养基培养24 h，使细胞贴壁生长。显微镜下观察孵育48 h 后的BCSC 球形态，拍照。并统计成球率（细胞成球标准为紧密的非多细胞悬浮性球体，直径大于50µm）。细胞成球率（%）=细胞球体数/每孔所接种细胞数×100%。

1.2.5 相关基因mRNA 的表达

采用荧光定量聚合酶链式反应（PCR）法。以不同浓度（0，1，5，10 nmol/ L）雌激素处理BCSC 24 h 后，提取BCSC 的总RNA，计算RNA 浓度。取1 µg RNA，逆转录为cDNA，采用荧光定量PCR 法检测PI3K，AKT，mTOR mRNA的表达水平。。

1.2.6 统计学处理

采用SPSS 17.0 统计学软件分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BCSC 的获得

经连续2 周培养，从MCF-7 细胞中成功培养出了BCSC（见图1），且其中CD44 显著表达，而CD24 不表达（见图2）。

图1 乳腺癌干细胞的培养Fig.1 Culture of BCSCs

图2 乳腺癌干细胞的鉴定Fig.2 Identification of BCSCs

2.2 BCSC 的生长情况

与0 nmol/L 比较，1，5，10 nmol/L 雌激素作用下，BCSC 增殖能力显著升高，且随着雌激素浓度的升高和作用时间延长，BCSC 的增殖能力逐渐增强；但当雌激素浓度大于10 nmol/L 时，BCSC 的生长开始受到显著抑制（除0 h外，P＜0.05）。详见图3。

图3 乳腺癌干细胞的生长情况Fig.3 Growth of BCSCs

2.3 BCSC 自我更新情况

与0 nmol/L 比较，10 nmol/L 和20 nmol/L 雌激素作用下BCSC 体积均显著增大，数量显著增多（见图4）；当雌激素浓度为20 nmol/ L 时，BCSC 的2 个指标均低于浓度为10 nmol/L时。

图4 乳腺癌干细胞自我更新情况Fig.4 Self-renewal of BCSCs

2.4 BCSC 相关基因mRNA 的表达

与0 nmol/L 比较，1，5，10 nmol/L 雌激素作用下，BCSC 的PI3K，AKT，mTOR mRNA 表达水平均显著升高（P＜0.05），且在低浓度（1，5，10 nmol/ L）雌激素作用下存在浓度依赖性（见图5）。

图5 乳腺癌干细胞相关基因mRNA的表达Fig.5 Expression of related gene mRNA in BCSCs

3 讨论

近年来，手术切除和内分泌靶向治疗在乳腺癌治疗中已取得显著进展，但复发和转移仍然是乳腺癌患者面临的两大死亡原因［7］。临床医师常长期补充雌激素治疗妇科内分泌疾病，但该治疗方法存在很大争议。有研究报道，补充雌激素会显著增加罹患妇科肿瘤的概率，但同时也有研究者发现，这种疗法可减少妇科肿瘤的发生［8］。通过病例比对发现，长期服用雌二醇（E2）的绝经期妇女的卵巢癌发病率比未服用E2者提高了55%；分析1966年至2006年大部分相关研究发现，雌激素疗法实可显著增加卵巢癌的发生风险。绝经期妇女补充雌激素者乳腺癌发病率相较未补充者可显著升高［9-10］。

国外近年有研究报道，不同浓度雌激素对MCF-7细胞生长的影响不同，其中，高浓度（20 nmol/ L）雌激素对MCF - 7 细胞生长有一定抑制作用［11-12］，但高浓度的雌激素对MCF - 7 细胞的抑制作用可能并不依赖于雌激素受体，不同浓度的雌激素作用于MCF - 7 细胞，可能产生不同效果。另有报道表明，雌激素对胸腺癌肿瘤的发生发展、对化疗耐药及复发转移过程也存在相同作用［13］。本研究结果显示，10 nmol/L 雌激素作用24 h可明显促进BCSC的自我更新能力，但20 nmol/L雌激素反而抑制其自我更新。

PI3K/AKT/mTOR 信号通路的异常激活与癌细胞的增殖、膀胱癌干细胞（BCSC）的存活和耐药性密切相关。RTK，GPCRs，Ras 可激活PI3K，激活后的PI3K 可活化其下游因子AKT 和PDK1。此外，mTOR，p70S6K，4E-BP1 和糖原合成酶激酶3（GSK3）是AKT 的下游效应因子，可被AKT 激活，以刺激癌细胞的蛋白质合成、生长、增殖和迁移［14-15］。本研究结果显示，经雌激素诱导后，BCSC 的PI3K，AKT，mTOR mRNA 的表达水平均显著升高，且存在浓度依赖性，这可能意味着较低浓度（10 nmol/ L）的雌激素能有效促进PI3K/ AKT/ mTOR信号通路相关基因的表达。

综上所述，低浓度（10 nmol/L）雌激素可提高BCSC的增殖、自我更新能力，此作用可能涉及PI3K/ AKT/mTOR信号通路，但仍需进一步研究。