百令胶囊上调miR-145-5p 逆转TGF-β1/Smad3通路机制初探*

冯 平，姬泽萱，陈丽萍，王 布

（河北北方学院附属第一医院，河北 张家口 075000）

1 材料与方法

1.1 仪器、试药、动物与细胞

仪器：Finepointe 型无限制肺功能测试体积描记仪（美国Buxco 公司）；DSX1000 型光学显微镜和摄影系统、BX53 型荧光显微镜（日本Olympus 公司）；SJ - 8 型微孔板读取器（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；CR30NX 型离心机（美国Eppendorf 公司）；UV2700 型紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）。

试药：BLC（杭州中美华东制药有限公司，批号为2005118D）；卷烟（芙蓉王滤嘴卷烟，湖南中烟工业有限责任公司，批号为063814，每支含焦油11 mg、尼古丁1.0 mg、一氧化碳12 mg）；Smad3 一抗（美国Cell Signaling Technologies 公司，批号为ybs9316）；Alexa Fluor 488共轭二抗（英国Abcam 公司，批号为330192）；4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，批号为Az402），Trizol 试剂（批号为R0024），DMEM 培养基（批号为1105119），均购自美国Invitrogen公司；CCK-8分析试剂盒（日本Dojindo公司，批号为abs50013）；转化生长因子（TGF）-β1酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（天津一安生物技术有限公司，批号为DB203F）；TaqMan microRNA 逆转录试剂盒（批号为T90F42）、SYBR green（批号为S9137），均购自美国Applied Biosystems 公司；Mayer 苏木精（批号为A200407），1%伊红（批号为A217362），均购自南京生航生物技术有限公司；10% 胎牛血清（FBS，批号为SH30070.03），100 IU/mL 青霉素和100µg/mL 链霉素（批号为J130061），均购自美国Hyclone公司。

动物：SD大鼠，雌雄各半，年龄6～8 周，体质量（200 ±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号SCXK（沪）2022 - 0008。在相对湿度（50±10）%、温度（25±2）℃和光照（12 h 光/暗循环）下适应性饲养7 d，自由进食饮水。

菌种及细胞：肺炎克雷伯菌（中国典型培养物保藏中心，编号为M2019851）；BEAS-2B 细胞株（美国细胞培养收藏中心，编号为H-EMC-63）。

1.2 方法

1.2.1 在体实验

模型建立［7］：将大鼠置密闭空间（50 cm × 60 cm ×70 cm），暴露于8 支香烟的烟雾中，每天2 次，每次30 min，前2 周内无烟间隔3 h；随后的10 周内，暴露于15 支香烟的烟雾中，每天3 次，每次30 min，无烟间隔3 h。前8 周内每5 天接种1 次肺炎克雷伯菌悬液（6 ×108cfu/mL，100µL）。对照大鼠暴露于空气中。

分组及给药：建模第9 周，将60 只大鼠分为正常对照组（2 mL 生理盐水）、模型组（2 mL 生理盐水）、BLC 组（5.5 mg/kg［8］）、miR-145-5p inhibitor 阴性对照片段（inhibitor NC）组［5.5 mg/kg BLC+6µL（0.02 nmol/µL生理盐水）inhibitor NC］、miR-145-5p inhibitor（inhibitor）组［5.5 mg/kg BLC+6µL（0.02 nmol/µL 生理盐水）inhibitor］，各12 只。大鼠分别灌胃相应药物及生理盐水，每天1 次，连续8 周；inhibitor NC 及inhibitor 以尾静脉给药，每周1 次，连续8 周。本研究方案经医院医学伦理委员会批准（批件号K2020047）。

主要对波纹结构对流动的影响进行分析，取入口速度恒为1m/s。设为速度入口边界；压力出口边界，压力值为0Pa；管道壁面设为无滑移边界。

肺功能：大鼠予腹腔注射戊巴比妥钠（35 mg/kg）麻醉，置连接Buxco 气流传感器的参考室内。每4 周评估1 次潮气量（TV）、呼气峰流量（PEF）和分钟通气量（MV）。第16 周，麻醉大鼠，测定用力肺活量（FVC）和第0.3秒用力呼气容积（FEV0.3）。

病理形态：末次给药后，收集大鼠左下叶肺组织样本，用10%过氧化氢（H2O2）溶液固定，石蜡包埋，制成4 µm 厚切片。1）用Mayer 苏木精和1%伊红染色，置光学显微镜下观察。使用Adobe Photoshop CC 软件的计数工具计算肺泡平均线性截距（µm）和平均肺泡数（单位面积为1 mm2）。2）将切片在二甲苯中脱蜡，用分级乙醇水合；置121 ℃高压灭菌器中10 min 提取抗原，在25 ℃条件下、以3%H2O2孵育0.5 h 以阻断内源过氧化物酶活性。将切片用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，并用10% 山羊血清孵育0.5 h，然后与Smad3 的一抗（1∶500，V/V）孵育过夜。次日，在37 ℃条件下用过氧化物酶结合的二抗孵育60 min，再用3，3' - 二氨基联苯胺进行免疫染色，以苏木精进行复染，置光学显微镜下观察。

TGF - β1表达：末次给药后，取0.2 g 大鼠肺组织，于2 mL生理盐水中匀浆，1 000 r/min离心15 min，得上清液，用ELISA法测定TGF-β1的表达水平。

miR - 145- 5p mRNA 表达：采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）法。以Trizol法提取RNA，鉴定其纯度和完整性并反转录制备cDNA；PCR 反应条件为，95 ℃预变性1 min；95 ℃变性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循环40 次；72 ℃延伸5 min 终止反应。RT-qPCR 反应结束后，定量分析获得的熔解曲线和扩增曲线结果，并设定循环阈值（Ct），以U6 小RNA 为内源性对照，用2-ΔΔCt法计算RNA 的相对表达量。引物如下：miR - 145 - 5p（正向，5' - GGACGGACAGGGAGGCCAAA - 3'；反向，5' - TTTGGCCTCCTCTCGCTCGCGCGTCC - 3'）和U6（正向，5' - CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；反向，5'-AACGCTTCGCGCAGGCAA-3'）。各组设3个复孔，实验重复3次。

1.2.2 离体实验

香烟烟雾提取物（CSE）制备［9］：将2 支点燃香烟的烟雾鼓入10 mL DMEM 培养基中，并经0.22µm 过滤器滤过，制备新鲜原始溶液，测定吸光度（OD）。将320 nm波长处的溶液作为100%CSE。

BLC 药物血清（BLC - S）制备：取10 只大鼠，均灌胃5.5 mg/kg BLC，每天1次，连续7 d。末次给药后2 h，腹主动脉取血，3 000 r/ min 离心15 min，取上清液；56 ℃条件下灭活30 min，经0.22 µm 过滤器滤过，得BLC-S，贮藏于-80 ℃，备用。另取10 只大鼠灌胃等体积生理盐水，同法制备空白血清。

细胞活力：采用CCK-8法检测。BEAS-2B细胞培养于含10%FBS、100 IU/mL 青霉素和100µg/ml 链霉素的DMEM 培养基中。取对数生长期的细胞，以每孔3 000 个的细胞密度接种于96 孔培养板中，孵育12 h，将细胞暴露于0（空白对照），3%，5%，10%，20% CSE中，加5%，10%，20%，40%BLC - S 孵育48 h；加10 µL CCK - 8 溶液孵育2 h，检测450 nm 波长处的OD。细胞活力（%）=（ODBLC-S-ODblank）/（ODcon-ODblank）×100%。实验重复3次。

TGF-β1表达：取对数生长期的细胞，以BEAS-2B细胞与5%CSE 和20%BLC - S 孵育48 h，收集培养基，3 000 r/ min 离心15 min，取上清液，用ELISA 法测定TGF-β1的表达水平。

Smad3 表达：取对数生长期的细胞，与5%CSE 和20%BLC-S 孵育48 h，4 ℃条件下以4%多聚甲醛冰凉溶液固定20 min，用0.5%Triton X - 100 渗透，用3%BSA在室温下封闭1 h。将细胞与Smad3一抗（1∶200，V/V）在4 ℃下孵育过夜；洗涤，将细胞与Alexa Fluor 488 共轭二抗（1∶5 000，V/V）在室温下孵育2 h；洗涤，用DAPI对细胞核染色5 min，置荧光显微镜下观察。

miR-145-5p mRNA表达：取对数生长期的细胞，将BEAS - 2B 细胞与5%CSE 和20%BLC - S 孵育48 h。按相应方法检测miR-145-5p mRNA的表达水平。

1.2.3 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠肺功能

与正常对照组比较，模型组大鼠TV，MV，PEF，FVC，FEV0.3均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，BLC 组及inhibitor NC 组大鼠上述指标均显著升高（P＜0.05）；与inhibitor NC 组比较，inhibitor组大鼠上述指标均显著降低（P＜0.05）。详见图1（其中与正常对照组/ 空白对照比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组/5%CSE 条件比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与inhibitor NC 组/5%CSE+20%BLC-S+inhibitor NC 条件比较，&P＜0.05。图2，图4至图7同。）。

图1 各组大鼠肺功能指标Fig.1 Lung function indicators in each group

图2 各组大鼠肺泡数及直径Fig.2 Alveolus count and diameter in each group

2.2 大鼠肺组织病理形态

模型组大鼠肺组织出现如肺泡破坏和肺泡腔扩张等严重病理变化。与模型组比较，BLC组及inhibitor NC组大鼠肺组织病理形态显著改善，平均肺泡数显著增加，肺泡直径显著减小（P＜0.05）；与inhibitor NC 组比较，inhibitor组大鼠肺组织病理形态未改善，且平均肺泡数显著减少，肺泡直径显著增长（P＜0.05）。详见图2、图3。

图3 各组大鼠肺组织形态（HE，×100）Fig.3 Morphology of lung tissue in each group（HE，× 100）

2.3 细胞活力

5%CSE作用48 h时，细胞活力降低约50%（图4 A）。与空白对照比较，5%～40%BLC-S 未显示出明显的细胞毒性（图4 B），故选择20%BLC-S 为后续实验浓度。与5%CSE 条件比较，5%CSE+20%BLC-S 条件下的细胞活力显著增强（P＜0.05，图4 C）。

图4 细胞活力Fig.4 Cell viability

2.4 Smad3 表达水平

与正常对照组比较，模型组大鼠肺组织中Smad3表达水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，BLC 组和inhibitor NC 组大鼠肺组织中Smad3 表达水平显著降低（P＜0.05）；与inhibitor NC 组比较，inhibitor 组大鼠肺组织中Smad3 表达水平显著升高（P＜0.05）。详见图5 A。与空白对照比较，5%CSE 条件下细胞中Smad3表达水平显著升高（P＜0.05）；与5%CSE 条件比较，5%CSE+20%BLC-S 条件下细胞Smad3表达水平显著降低（P＜0.05）；与5%CSE + 20%BLC - S + inhibitor NC 条件比较，同水平inhibitor 条件下细胞Smad3 表达水平显著升高（P＜0.05）。详见图5 B。

图5 Smad3的表达Fig.5 Expression of Smad3

2.5 TGF-β1 表达水平

与正常对照组比较，模型组大鼠肺组织中TGF-β1表达水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，BLC 组和inhibitor NC 组大鼠肺组织中TGF-β1表达水平显著降低（P＜0.05）；与inhibitor NC 组比较，inhibitor组大鼠肺组织中TGF-β1表达水平显著升高（P＜0.05）。详见图6 A。与空白对照比较，5%CSE条件下细胞中TGF-β1表达水平显著升高（P＜0.05）；与5%CSE 条件比较，5%CSE+20%BLC-S条件下细胞TGF-β1表达水平显著降低（P＜0.05）；与5%CSE + 20%BLC -S+inhibitor NC 条件比较，同水平inhibitor 条件下细胞TGF - β1表达水平显著升高（P＜0.05）。详见图6 B。

图6 TGF-β1的表达水平Fig.6 Expression level of TGF-β1

2.6 miR-145-5p mRNA 表达水平

与正常对照组比较，模型组大鼠肺组织中miR -145 - 5p mRNA 表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，BLC 组及inhibitor NC 组大鼠肺组织中miR -145-5p mRNA表达水平显著升高（P＜0.05）。与inhibitor NC 组比较，inhibitor 组大鼠肺组织中miR-145- 5p mRNA 表达水平显著降低（P＜0.05）。详见图7 A。与空白对照比较，5%CSE 条件下细胞中miR - 145 - 5p mRNA 表达水平显著降低（P＜0.05）；与5%CSE 条件比较，5%CSE + 20%BLC - S 条件下细胞miR - 145 - 5p mRNA表达水平显著升高（P＜0.05）。详见图7 B。

图7 miR-145-5p mRNA的表达水平Fig.7 Expression level of miR-145-5p mRNA

3 讨论

吸烟被认为是COPD 的主要风险因素［1］。长期暴露于烟雾会增加轻度稳定期COPD 模型小鼠肺组织纤维化［10］。有研究表明，COPD 患者在常规治疗基础上加用BLC 后，其肺通气换气功能、呼吸困难等不适症状有了显著改善［11］。本研究中证明了BLC 可抑制COPD 模型大鼠肺功能下降、病理改变和纤维化反应；此外，BLC能增强暴露于CSE 的BEAS-2B细胞活力，并阻断细胞中TGF-β1/Smad通路。

持续暴露于CSE 会导致肺部miRNA 的失调，这与各种呼吸系统疾病有关，如肺结核、哮喘、肺癌及COPD［12］。暴露于香烟的COPD 模型大鼠肺组织中miR - 145 下调，并且已提出miR - 145 表达水平与COPD 的诊断密切相关［13］。miR - 145 - 5p 水平降低与5～12 岁哮喘儿童人群的肺生长早期下降有关，并且基线miR-145-5p水平降低也与随访结束时（23～30岁）研究人群的COPD发生相关［6］。本研究中，在COPD模型大鼠肺组织及暴露于CSE 的BEAS - 2B 细胞中均发现miR-145-5p 水平显著下调，而BLC 显著逆转了该趋势。此外，miR - 145 - 5p inhibitor 的加入明显逆转了BLC 对COPD 模型大鼠的保护作用，体现在肺功能指标降低，平均肺泡数减少和平均线性截距增长。表明BLC可通过上调miR-145-5p水平发挥COPD保护作用。

有研究证实，miR - 145 - 5p 上调能减轻COPD 模型大鼠肺组织纤维化程度［9］。TGF-β1介导的Smad3 信号在与烟雾刺激、博来霉素激发和肿瘤进展/发展相关的上皮间质转化（EMT）中的关键作用已得到证实［14］。TGF-β1信号通过跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体转导，将1 型受体内化到核内体中，用于受体激活的Smad 锚与Smad3 复合物的形成。之后Smad 在丝氨酸残基处磷酸化，促进Smad2/3 和Smad4 之间的相互作用，然后易位到细胞核，并通过与Smad 结合元件相互作用来调节EMT 相关基因的转录［15-16］。基于Smad3 在TGF- β1介导的EMT 过程中发挥更关键作用，本研究中重点关注BLC对TGF-β1/Smad通路的影响。结果证实，在COPD模型大鼠肺组织和暴露于CSE 的BEAS - 2B 细胞中TGF-β1/Smad 信号通路激活，BLC 显著抑制了该通路激活。进一步分析显示，miR-145-5p inhibitor的加入阻断了BLC对TGF-β1/Smad信号通路的抑制作用。但本研究还存在一定局限性，除TGF-β1/Smad 外，还应研究与纤维化进展相关的其他信号，包括PI3K/Akt 和ERK。

综上所述，BLC在体内和体外均显示出对香烟诱导COPD的保护作用，其机制可能与上调miR-145-5p水平逆转暴露香烟激活的TGF-β1/Smad3信号通路有关。