“褪黑素通过FoxO1 信号通路调控氧化应激诱导蛋鸡卵巢颗粒细胞凋亡的分子机制”项目完成验收

2023-08-29

北方牧业 2023年16期

2023 年7 月25 日，由河北农业大学陈辉教授主持的河北省自然科学基金项目 “褪黑素通过FoxO1 信号通路调控氧化应激诱导蛋鸡卵巢颗粒细胞凋亡的分子机制”（编号：C2020204163）的验收材料通过河北省基金办审核通过，完成验收。

随着我国家禽业迅速发展，集约化养殖程度大大提高，密集养殖环境中存在大量刺激会造成机体与组织中的活性氧的增加，导致机体产生氧化应激反应，最终导致家禽的生产性能下降。卵泡发育全过程都伴随着卵巢颗粒细胞（OGC）的生长，OGC 在调节卵泡发育、成熟和闭锁等过程中有重要作用。氧化应激会造成OGC凋亡，引起家禽卵泡闭锁而最终导致产蛋率下降，因此改善卵巢的氧化应激，减少机体内活性氧（ROS）水平，对于提高蛋鸡生产性能非常重要。本项目基于体内外氧化应激模型解析了FoxO1 信号通路参与褪黑素介导的蛋鸡卵巢颗粒细胞抗凋亡保护机制，为深入研究保护卵泡发育和延长蛋鸡利用周期奠定良好的理论基础。主要完成内容如下：

1 褪黑素通过抑制FoxO1 基因缓解蛋鸡体内卵巢氧化损伤研究

褪黑素具有直接清除ROS 的能力，也可以通过激活体内其他抗氧化酶，如谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等，来保护生物膜和DNA 分子，提升机体抗氧化水平。此外，褪黑素在调控卵泡发育、排卵、卵母细胞成熟和黄体功能方面发挥重要作用。因此，褪黑素及其代谢产物作为内源性的自由基清除剂和广谱抗氧化剂，可以有效对抗氧化应激引起的功能紊乱。在我们的结果中发现，利用地塞米松处理建立体内氧化应激模型，外源褪黑素处理后可显著提高了氧化应激模型下的CAT、SOD1、GPX3 和PRDX3 等抗氧化基因的mRNA 表达，显著提高Caspase-3、Bim 和Bax 抗凋亡基因的mRNA 表达，并显著抑制FoxO1 基因的mRNA表达，证明了FoxO1 基因参与了褪黑素调控蛋鸡卵巢氧化损伤的过程。

2 构建颗粒细胞氧化应激模型

正常的情况下，动物机体内的氧化与抗氧化系统处于动态平衡状态，在外界不良因素的刺激下对ROS 极为敏感，易受ROS 的攻击而形成氧化应激损伤。H2O2对细胞膜更具渗透性，极易在细胞间或者细胞内扩散，稳定且易获得，因此，本研究选取产蛋高峰期蛋鸡的颗粒细胞，分别用0、12.5、25、50、100、200 微摩尔/升H2O2处理3、6、9 小时，用CCK8 法检测细胞增殖活性，并利用抗氧化标志产物（丙二醛、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶）验证颗粒细胞氧化应激模型的建立。研究结果显示，在50 微摩尔/升浓度H2O2刺激6 小时，与对照组相比，其相对存活率约为60%，细胞存活率显著下降，细胞丙二醛水平显著增加，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性显著降低，因此，可以以该条件来建立蛋鸡OGC氧化应激模型。

3 FoxO1 通路介导褪黑素调控氧化应激诱导蛋鸡卵巢颗粒细胞凋亡的分子机制研究

氧化应激可以导致家禽ROS 大量积累，进而引起OGC 凋亡，引起卵泡闭锁，影响机体繁殖性能。通过H2O2处理建立体外氧化应激模型，H2O2显著提升了促凋亡相关基因Bim、Bax和Caspase-3 的表达量，显著抑制了抗凋亡基因Bcl-2的表达，而M+H2O2共同处理组后Bim、Bax 和 Caspase -3的表达量显著低于H2O2组，而Bcl-2 的表达量显著高于H2O2组，表明褪黑素显著缓解了H2O2带来的对颗粒细胞的凋亡效应。H2O2显著提升了FoxO1 基因的表达，而M+H2O2共同处理组FoxO1 的表达量显著低于H2O2组，表明褪黑素通过抑制FoxO1 基因的表达显著缓解了H2O2带来的对颗粒细胞的氧化应激。再通过si-RNA技术和过表达载体方法建立特异性干扰FoxO1模型，发现抑制FoxO1（si-FoxO1）或者过表达FoxO1（过表达载体pcDNA3.1-FoxO1）后，颗粒细胞的增殖或凋亡都受到抑制或者增强，而抗氧化基因（SOD1、SOD2、CAT、GPX3 和PRDX3）和凋亡基因（Bim、Bax 和Caspase-3）的mRNA和蛋白的表达量也同等程度的被抑制或增强，但是给予褪黑素处理后缓解了氧化应激带来的损伤，进一步验证了FoxO1 信号通路参与褪黑素抑制氧化应激诱导的卵巢颗粒细胞凋亡。

本项目最终探明50 微摩尔/升H2O2处理蛋鸡卵颗粒细胞6 小时可建立氧化应激模型；100微摩尔/升褪黑素可通过清除ROS 及强化SOD、CAT、GPX3、PRDX3 等抗氧化基因和蛋白表达来缓解H2O2诱导的OGC 的氧化应激损伤，为我国蛋鸡健康养殖奠定了良好的理论基础。