鸡传染性支气管炎诊断方法的研究进展

夏立业

摘 要：鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒引起的一种呼吸道传染病。传染性支气管炎病毒传染性较强，给养鸡业的健康发展带来严重威胁。该病毒具有较多的血清型，且经常出现变异，因此需要做好鸡传染性支气管炎的诊断工作，能最大程度控制本病的传播。本文综述了病毒分离鉴定、血清学诊断和分子生物学诊断等几种常用的鸡传染性支气管炎诊断方法，以期为生产中该病的准确诊断提供参考。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒；病毒分离鉴定；血清学诊断；分子生物学诊断

中图分类号：S854.4+3 文献标识码：A 文章编号：1673-1085（2023）08-0070-04

传染性支气管炎是危害鸡的一种重大疾病，给世界养鸡业造成了巨大的经济损失[1]。该病的病原为鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV），是一种典型的RNA病毒，具有突变率和重组率高的特点，在不同的国家或地区往往流行不同的血清型[2]。鸡传染性支气管炎的临床症状与其他禽类的呼吸道感染性疾病相似，很难与其他呼吸道病毒感染区分开来[3]，这就对鸡传染性支气管炎病毒感染的诊断方法提出了很高的要求。近年来，由于禽类养殖业的快速发展，也给该病的防控带来了极大的挑战。本文综述了病毒分离鉴定、血清学诊断和分子生物学诊断等几种用于鸡传染性支气管炎诊断的主要方法，以期为该病的准确诊断提供一定的参考。

1 病毒分离鉴定

病毒分离鉴定是鸡传染性支气管炎的常见诊断方法。在养殖过程中，为了诊断鸡群中是否存在感染传染性支气管炎病毒的鸡，应分别从健康鸡和有临床症状的鸡体内采集样本。由于该病主要侵害鸡的呼吸系统和生殖系统，通常选择疑似感染传染性支气管炎的患病鸡气管组织或拭子作为待检测的样本，若处于急性发病期，特别是剖检存在病变时，也可以采集患病鸡的肾脏或输卵管[4]；同时可以尝试采集盲肠扁桃体和泄殖腔拭子，但这些部位的病毒分离率一般较低。当试图采取分离病毒的方法进行该病的诊断时，应尽早采集样本，因为鸡传染性支气管炎病毒的滴度在感染后第一周即达到峰值，这时可能某些患病鸡的临床表现还不明显。所采集的样本应小心地存放在冰上，并迅速送往实验室，以最大限度地保持病毒活力。鸡胚肾上皮细胞和肾成纤维细胞等可用于鸡传染性支气管炎病毒的分离，但无特定病原体鸡的鸡胚尿囊腔或气管组织培养物接种被认为是分离该病毒更有效的方法[5]。鸡传染性支气管炎病毒在鸡胚中培养时可引起尿酸盐沉积，胚胎发育迟缓、蜷曲或死亡，而在气管组织培养物中培养可造成纤毛停滞。当使用鸡胚接种培养时，通常需要连续传代三次才能够观察到病变，而使用气管组织培养物接种培养时则在第一次传代后即可见。但无论采取上述哪种接种方式，不能仅仅依靠观察到的上述病变作为确诊该病的依据，还应该采用血清学或分子生物学的方法对病毒分离株进行进一步鉴定。金娟等[6]利用鸡胚培养、气管环及动物回归试验、电镜观察、RT-PCR等多种方法相结合的方式成功从疑似患病鸡组织病料中分离到1株鸡传染性支气管炎病毒。目前，病毒分离鉴定的诊断方法耗时较长且实验要求较高，因此在实际生产中并不常用，但它仍用于病毒致病性评估、疫苗保護作用评估等其他几个领域。

2 血清学诊断方法

目前，用于鸡传染性支气管炎病毒诊断的血清学方法主要包括琼脂凝胶沉淀试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、病毒中和试验与血凝抑制试验。

琼脂凝胶沉淀试验反应快速，成本也不高，但需要制备用于沉淀反应的IgM抗体，且其反应的敏感性较差，只有在感染几周后才能检测出来，所以没有得到广泛的应用。

考虑到成本和操作的便捷性等因素，ELISA是最常用于传染性支气管炎病毒常规血清学检测的方法，该方法还可用于监测蛋鸡和种鸡中鸡传染性支气管炎疫苗接种后的反应情况。程旭等[7]以感染QX型鸡传染性支气管炎的Vero细胞适应株为包被抗原建立了一种间接ELISA抗体检测方法，可应用于免疫鸡群后抗体水平监测及早期感染预警。李新伟[8]针对新疆某养禽公司鸡传染性支气管炎免疫情况进行ELISA抗体监测，通过监测数据为新疆鸡传染性支气管炎免疫程序的调整提供了依据。由于抗体滴度可能会受到鸡群的品种、日龄、接种计划和时间等多种因素影响，因此，对于定期监测养殖场，需要确定基准值以确保监测结果的准确性和稳定性[9]。现有的大多数ELISA试剂盒在设计时主要是采用的针对鸡传染性支气管炎病毒全病毒粒子的多克隆抗体，并不能用于血清分型。近年来，研发人员已经陆续开发出了几种新型的商用ELISA试剂盒，这些试剂盒采用的是基于病毒血清型或菌株特异性设计的单克隆抗体，可精准检测出病毒的血清型分类[10]。

病毒中和试验与血凝抑制试验可以识别鸡传染性支气管炎病毒血清型特异性抗体，因此有助于区分野毒毒株和疫苗毒株。然而，由于使用血凝抑制试验时容易发生交叉反应，而病毒中和试验进行常规监测又过于费时费力，因此病毒中和试验更多的是作为血清分型的方法来应用。此外，最近还开发了其他血清学诊断方法，但这些方法的商业化和临床使用还需要一段时间[11-12]。

3 分子生物学诊断方法

近年来，随着分子生物学检测手段的不断发展和完善，该方法已成为鸡传染性支气管炎病毒检测中使用最多的工具。这类方法的灵敏度高、反应时间快，不仅能用于病毒的快速检测，还可以从遗传角度对检测到的毒株特征进行描述，从而可以合理地制定疫苗接种方案。目前，很多分子生物学的诊断方法都是基于反转录聚合酶链式反应（RT-PCR），这些方法有的是针对几乎所有鸡传染性支气管炎病毒亚型的通用方法，有的则是针对其基因型或毒株的特异性方法。采用RT-PCR方法可对样本中存在的病毒进行定量，这有助于判断疾病是否主要由鸡传染性支气管炎病毒引起，而且定量检测疫苗毒株滴度还可用于评估疫苗接种效果和持久性。赵秀美等[13]通过设计针对鸡传染性支气管炎病毒株5′端非编码区保守区域序列的特异性引物，建立了一种能够快速定量检测该病原且具备良好特异性和重复性的RT-PCR方法。鸡传染性支气管炎病毒的遗传变异主要集中于病毒的S1基因，因此该基因也成为PCR方法最常用的靶向区域。陈淑琴等[14]根据不同基因型的鸡传染性支气管炎病毒S1基因序列差异较大的区域设计特异性引物和探针后建立的RT-PCR检测方法，能够快速鉴别GVI-1基因型毒株与其他基因型毒株。当存在多个毒株同时感染的情况时，通用的RT-PCR和Sanger测序只能检测到具有最高滴度的一个毒株。而不同引物的特异性不同也可能引起检测结果的偏差，因此不同的检测方法检测到不同的毒株是很常见的。在实际生产中，应该针对养殖地区流行的毒株来选择通用或特异性的RT-PCR检测方法。

限制性酶切片段长度多态性分析是一种通过病毒基因限制性酶切图谱进行分型的方法。该方法结合了RT-PCR技术，主要原理是提取编码病毒抗原表位基因，采用RT-PCR扩增DNA片段，随后用限制性内切酶进行处理，根据酶切图谱进行病毒分型。Kwon等[15]采用RT-PCR技术扩增出含S1基因、长度为1 720 bp的传染性支气管炎病毒基因序列，随后进行纯化及限制性内切酶处理检测，发现检测结果与中和试验得出的病毒血清分型一致，表明限制性酶切片段长度多态性分析技术可用作鸡传染性支气管炎病毒诊断。但值得注意的是，鸡传染性支气管炎病毒会不断发生变异和进化，因此需要定期更新所用的限制性内切酶。

近年来，其他的分子生物学诊断技术，如环介导等温扩增技术（LAMP）、核酸探针技术和基因芯片技术等也已被用于鸡传染性支气管炎病毒的检测。Wu等[16]将RT-LAMP与横向流动试纸（LFD）相结合，建立了一种能同时检测鸡传染性支气管炎病毒和新城疫病毒的新型检测方法。赵玉佳等[17]构建了联合检测鸡传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒和新城疫病毒的基因芯片，并对芯片的敏感性、特异性及稳定性进行了评价，结果显示该检测技术能够用于临床病料中上述三种病原的检测和快速诊断。此外，下一代测序技术最近也被用于研究，尽管目前这种方法对于常规使用来说过于昂贵和费力，但也可实现特定的检测目的[18]。

4 小结

传染性支气管炎严重影响到鸡的健康生长，为了降低该病的发生率，需做好日常监测和预防，而对该病的准确诊断是有效开展防控的基本保障，具有十分重要的意义。目前，该病的诊断方法除了上述提到的病毒分离鉴定、血清学诊断和分子生物学诊断三种主要方法外，免疫组织化学技术和蛋白芯片技术等也得到了探索和应用。但无论哪种方法都有各自的优势和缺点，单一一种方法在目前都还难以完全满足检测所要求的快速、灵敏、特异、简便、经济和实用等。因此，在实际检测时应该根据需要，结合拥有的实验条件和操作经验，选择最适宜的检测方法或将不同的方法结合起来应用，以便能够获得最好的效果。

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Advances in Diagnostic Methods of Avian Infectious Bronchitis

XIA Liye

（People's Government of Aoqi Town in the Suburb of Jiamusi City， Jiamusi  154012， China）

Abstract：  Avian infectious bronchitis is a respiratory infectious disease caused by infectious bronchitis virus. Infectious bronchitis virus （IBV） is highly infectious， which poses a serious threat to the healthy development of chicken industry. The IBV has many serotypes and often mutates， so it is necessary to do a good job in the diagnosis of infectious bronchitis in order to control the spread of the disease. In this paper， several common diagnostic methods of avian infectious bronchitis， such as virus isolation and identification， serological diagnosis and molecular biological diagnosis， were reviewed in order to provide the reference for the diagnosis of the disease.

Keywords：  Avian infectious bronchitis virus; Virus isolation and identification; Serological diagnosis; Molecular biological diagnosis