平邑地区猪源大肠杆菌敏感药物筛选试验

陈宁宁，张伟锋，高大朋，董 强，丁永贵，孙 梅，李运喜

（山东省平邑县畜牧发展促进中心，山东 平邑 273300）

大肠杆菌是革兰氏阴性杆菌，主要存在于肠道中，属条件致病菌，在应激、机体抗病能力差时，容易引起机体腹泻等肠道疾病。大肠杆菌耐药性是由抗生素不规范使用造成的大肠杆菌对抗生素药物的敏感性下降，甚至不敏感现象。目前主要耐药性机制有固有耐药性和质粒转移等获得耐药性[1-3]。

本试验依据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准介绍的动物及其制品中细菌耐药性的测定纸片扩散法（SN/T1944-2016）进行试验和结果判断[4]。试验采集分离平邑7 家生猪养殖场21株大肠杆菌，检测该场大肠杆菌对临床常用的庆大霉素、恩诺沙星、阿莫西林、氟苯尼考、多四环素、黏菌素6 种抗生素的敏感性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要设备 高压灭菌锅（ZDX-35B1），购自上海申安医疗器械厂；电热恒温培养箱（DHP-9032），购自龙口市先科仪器公司；紫外分光光度计（ULTROSPEC3100PRO），购自英国Biochrom 公司；电子分析天平（AR1530），购自奥豪斯国际贸易（上海）有限公司。

1.1.2 材料 伊红美蓝琼脂培养基、普通琼脂培养基（MHA）、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）购自北京陆桥技术责任有限公司；6 种抗生素药敏片、革兰氏染液购于常德比克曼生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 用无菌棉签采集100 日龄左右的健康三元育肥生猪肛门拭子，放于2 mL 灭菌生理盐水中。

1.2.2 细菌分离培养 将伊红美兰琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）121 ℃，15 min高压灭菌，冷却到55 ℃（手感微烫）时，在超净工作台中倒入培养皿板，待培养基凝固后，倒置晾干培养皿盖上的水珠后，备用。

将已放入灭菌生理盐水的肛拭子样品振荡后，用接种环蘸取少量液体样品，然后轻轻划线于伊红美兰培养基上，37 ℃ 培养16 h 左右。挑取具有金属光泽的单个菌落，多次纯化直到培养基上菌落形态一致。

1.2.3 镜检 挑取伊红美兰琼脂培养基具有金属光泽的单个菌落，用生理盐水稀释，涂于载玻片上，自然干燥；加结晶紫溶液染色30 S，用清水冲去染液；加碘液染色30 S，用清水冲去染液；用70%酒精脱色30 S；用复红复染30 S，用清水冲去染液；油镜下观察细菌成红色、杆状。

1.2.4 大肠杆菌药物敏感实验 挑取具有金属光泽的单个菌落，致密划线于TSA 培养基，37 ℃培养16 h。用接种环刮取TSA 上的菌落，悬浮于2 mL 生理盐水中，用麦氏标准比浊管校正至0.5麦氏单位，相当于细菌1.5×108CFU/mL。用无菌棉签蘸取菌液，在管壁内轻轻旋转挤压，去掉多余菌液，均匀涂抹到MHA 培养基表面。用无菌镊子将标准抗菌药物纸片贴于琼脂表面，37 ℃培养16 h。

2 结果

本次试验采集7 家生猪养殖场样品，每场采集样品7 份，共采集样品49 份，每场分离到3株大肠杆菌，共计21 株猪源大肠杆菌。药敏结果如表1 所示：3 株猪源大肠杆菌对恩诺沙星的抑菌圈直径为6.3～7.0 mm，耐药率为14%，6 株猪源大肠杆菌对恩诺沙星的抑菌圈直径为19.9～22.1 mm，中介率29%，12 株猪源大肠杆菌对恩诺沙星的抑菌圈直径大于23.0 mm，敏感率为57%；3 株猪源大肠杆菌对庆大霉素的抑菌圈直径为6～7 mm，耐药率为14%，3 株猪源大肠杆菌对庆大霉素的抑菌直径圈为13～14 mm，中介率为14%，15 株猪源大肠杆菌对庆大霉素的抑菌圈直径大于15 mm，敏感率约为72%；21 株猪源大肠杆菌对阿莫西林的抑菌圈直径为 6 ～10 mm，耐药率为100%；15 株猪源大肠杆菌对氟苯尼考的抑菌圈直径为7～8 mm，耐药率为71%，6 株猪源大肠杆菌对氟苯尼考的抑菌圈直径为13.9～15.1 mm，中介率为29%，21 株猪源大肠杆菌对氟苯尼考敏感率为0；9 株猪源大肠杆菌对多四环素的抑菌圈直径为8～12 mm，耐药率为43%，6 株猪源大肠杆菌对多四环素的抑菌圈直径为13～14 mm，中介率为29%，6 株猪源大肠杆菌对多四环素的抑菌圈直径大于16 mm，敏感率为29%；21 株猪源大肠杆菌对黏菌素的抑菌圈直径大于18 mm，敏感率100%。

表1 猪源大肠杆菌抑菌圈直径 （mm）

3 讨论与结论

2021 年农业农村部印发了《全国兽用抗菌药使用减量化行动方案（2021—2025 年）》，2022年下达了《2022 年动物源细菌耐药性监测计划》，文件要求监测大肠杆菌等革兰氏阴性菌对阿莫西林/克拉维酸、庆大霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、黏菌素等16 种抗菌药的耐药性，并在部署2022 年畜牧兽医工作中，要求加快推进兽用抗菌药使用减量，山东省畜牧兽医局在《山东省兽用抗菌药使用减量化行动实施方案（2021—2025 年）》和2022 年畜牧兽医工作要点等重要文件中要求加强兽用抗菌药综合治理，有效遏制动物源细菌耐药。大肠杆菌耐药性监测工作一方面能准确地掌握大肠杆菌耐药性的发展趋势，另一方面能为养殖场户提供精准用药方案，避免抗生素乱用，推进兽用抗菌药减量化使用。

本次试验监测结果显示，平邑7 家生猪养殖场的21 株猪源大肠杆菌对恩诺沙星的耐药率为14%、中介率为29%、敏感率为57%；对庆大霉素的耐药率为14%、中介率为14%、敏感率约为72%；对阿莫西林的耐药率为100%；对氟苯尼考的耐药率为71%、中介率为29%、敏感率为0；对多四环素的耐药率为 43%、中介率为29%、敏感率为 29%；对黏菌素的敏感率100%。平邑地区生猪养殖场猪源大肠杆菌对阿莫西林耐药性比较高，对恩诺沙星、庆大霉素比较敏感，对黏菌素敏感。不同生猪养殖场猪源大肠杆菌耐药性不同，个别养殖场猪源大肠杆菌耐药性很高，出现了多重耐药性（对5 种抗生素耐药）。为更有效落实兽用抗菌药使用减量化行动，降低养殖场户生猪养殖成本，建议平邑7 家生猪养殖场，根据药敏结果，采用精准用药和轮换用药方式来防治猪源型大肠杆菌疾病，避免抗生素乱用，进一步推进兽用抗菌药减量化使用和兽用抗菌药综合治理。