华东部分地区CRE的临床特征、耐药情况及酶型分析

许恒贵,陈祝俊,赵清贵,王晓庆,杨 楠,陈凯丽,卢仁泉

1.江苏省泰州市姜堰中医院检验科,江苏泰州 225500;2.复旦大学附属肿瘤医院检验科,上海200032

近年来,随着抗菌药物的广泛使用和不规范应用,临床分离的病原菌耐药性越来越强[1]。据全国细菌耐药监测网发布的数据显示,肠杆菌目细菌占临床分离的全部革兰阴性菌的60%以上[2]。耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌(CRE)在全球快速增长流行[3],其中以耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CR-KPN)和耐碳青霉烯类大肠埃希菌(CR-ECO)最为常见[4]。目前,由于大多数对碳青霉烯类抗菌药物耐药的细菌也对临床常用的其他抗菌药物耐药,因此CRE的感染对患者生命健康造成极大威胁[5-8]。为进一步了解华东地区泰州市姜堰中医院、复旦大学附属肿瘤医院CRE的临床分布特征、耐药性及产碳青霉烯酶类型,为防控CRE院内感染提供理论依据、监测提供数据支撑,为临床经验用药和合理治疗提供依据,本研究对华东地区这两所医院2020-2021年的CRE分离情况进行回顾性分析,现报道如下。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集华东地区泰州市姜堰中医院、复旦大学附属肿瘤医院2020-2021年全年住院患者分离的非重复160株CRE菌株,菌株标本来自痰液、引流液、中段尿、血液、分泌物、导管(剔除同一患者相同部位标本分离的同种菌株)。

1.2培养基和药物敏感试验纸片 血平板、巧克力平板、药物敏感试验所用的培养基为Mueller-Hinton琼脂平板均购于安图公司,K-B法药物敏感试验纸片为英国Oxiod公司进口,微量肉汤稀释法检测板条购于康泰生物。

1.3方法

1.3.1病原菌分离鉴定与药物敏感试验 根据《全国临床检验操作规程》(第4版)的要求进行接种及分离培养,对临床送检标本分离肠杆菌目细菌并采用VITEK2-Compact全自动分析仪进行鉴定。使用生物梅里埃基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)系统对所有菌株鉴定结果进行复核。采用VITEK2-Compact全自动分析仪配套药物敏感试验卡(AST-NG 09/AST-GN334)进行药物敏感试验。使用康泰生物微量肉汤稀释板条对仪器法检测出亚胺培南和(或)美罗培南耐药菌株进行复核。质控菌株:大肠埃希菌(ATCC 25922)购于美国赛默飞公司。药物敏感试验按照美国临床和实验室标准协会(CLSI)M100-S30 标准操作和结果判定。耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌是指对亚胺培南、美罗培南、厄他培南或多利培南任何一种碳青霉烯类抗菌药物耐药[如亚胺培南、美罗培南、多利培南最低抑菌浓度(MIC)≥4 mg/L,或厄他培南MIC≥2 mg/L],或者证实产碳青霉烯酶的肠杆菌目细菌,其中摩根菌属、变形杆菌属、普罗威登菌属可呈现对亚胺培南天然非产酶机制的MIC升高,判断其为CRE时需同时伴有其他任意一种碳青霉烯类抗菌药物耐药[9]。

1.3.2碳青霉烯酶检测 利用抗原抗体免疫层析技术快速检测肠杆菌目细菌中的碳青霉烯酶,按照产品说明书操作,加样后(15 min)测试板上相应区域的标记线出现红色(除对照线外),则提示该细菌产生对应的碳青霉烯酶,该检测能检出5种碳青霉烯酶,分别是肺炎克雷伯碳青霉烯酶(KPC)、新德里金属β内酰胺酶(NDM)、维罗纳整合子编码的金属β内酰胺酶(VIM)、苯唑西林酶-48(OXA-48)和亚胺培南酶(IMP)。同时使用赛沛GeneXpert分子诊断系统Carba-R检测试剂盒对分离菌株所检测的碳青霉烯酶类别进行复核[8-10]。

1.4统计学处理 使用创业软件集团的医院信息系统及上海敏高软件有限公司医院检验信息管理系统对患者信息、标本种类、标本科室来源进行统计。使用Microsoft Office Excel 2007 软件对细菌分布组成、科室组成、标本来源组成、药物敏感性情况进行统计分析。

2 结 果

2.1CRE在标本、科室及菌种等临床特征分布情况 华东地区泰州市姜堰中医院、复旦大学附属肿瘤医院2020-2021年分离的非重复CRE 160株,其中以痰标本为主,共69株(43.1%),另外引流液标本32株(20.0%),中段尿标本28株(17.5%),血液标本10株(6.3%),分泌物标本8株(5.0%)。160株CRE科室中分布情况见表1。

表1 160株CRE在科室中分布情况

160株CRE 中CR-KPN 79株(49.4%),CR-ECO 34株(21.3%),耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌28株(17.5%),耐碳青霉烯类黏质沙雷菌9株(5.6%),耐碳青霉烯类弗劳地枸橼酸杆菌3株(1.9%),耐碳青霉烯类奇异变形杆菌2株(1.3%),耐碳青霉烯类杨氏枸橼酸杆菌、产气肠杆菌、阪崎克罗诺杆菌、产酸克雷伯菌、摩根摩根菌各1株(0.6%)。以上菌株鉴定结果均通过MALDI-TOF-MS复核,结果一致。

2.2CRE的耐药情况 160株CRE对氨苄西林、头孢唑林和环丙沙星耐药率100.0%,对其他头孢菌素及头孢-酶抑制剂抗菌药物耐药普遍较高,超过90.0%(头孢他啶-阿维巴坦外),对复方磺胺甲噁唑、庆大霉素的耐药率超过50.0%,对阿米卡星的耐药率为30.6%,相对较低。替加环素耐药率较低仅2.5%,多黏菌素B未见耐药株。见表2、图1。

图1 160株CRE药物敏感试验结果

表2 160株CRE对抗菌药物的耐药率

2.3CRE 碳青霉烯酶表型分析 对160株CRE产生的碳青霉烯酶进行检测并分型,依次为产KPC型碳青霉烯酶菌株72株[以肺炎克雷伯菌(45株)、大肠埃希菌(11株)、黏质沙雷菌(7株)为主]、产NDM型碳青霉烯酶菌株68株[以阴沟肠杆菌(24株)、大肠埃希菌(21株)、肺炎克雷伯菌(20株)为主]、产IMP型碳青霉烯酶菌株10株(均为肺炎克雷伯菌)、产KPC型碳青霉烯酶+产NDM型碳青霉烯酶菌株7株[分别为肺炎克雷伯菌4株、大肠埃希菌2株、产气肠杆菌1株]。此外,未检测到产OXA-48和VIM型碳青霉烯酶。另杨氏枸橼酸杆菌、阪崎克罗诺杆菌和阴沟肠杆菌各有1株未检测到碳青霉烯酶,推测所产酶型不能够被实验室检测系统所检出,或者其他机制引起的耐药表型。上述所有菌株酶型同时由赛沛GeneXpert分子诊断系统进行复核,检测结果一致。

3 讨 论

碳青霉烯类抗菌药物是一种抗菌活性强,抗菌谱广,对革兰阳性菌、革兰阴性菌及厌氧菌均具有抗菌作用的新型β内酰胺类抗菌药物,碳青霉烯类药物被认为是治疗耐药革兰阴性菌感染的最后一道防线[11]。但随着碳青霉烯类抗菌药物被滥用,CRE菌株的检出率也快速的上升,CRE所引起的严重感染或无症状定植也成为临床抗感染治疗的难题[12]。因此,研究临床上CRE的酶型分布及耐药情况,对临床经验用药和合理用药有着指导意义。目前认为CRE的耐药机制主要包括以下几方面:(1)产碳青霉烯酶、水解碳青霉烯类药物;(2)孔道蛋白缺失或表达降低而导致的外膜通透性降低[13];(3)青霉素结合蛋白对碳青霉烯类药物亲和力下降;(4)药物外排泵高度表达[13]。CRE耐药可以由以上一种或多种机制共同作用引起,其中以产碳青霉烯酶在临床上最常见。

本研究160株CRE中CR-KPN共79株,占49.4%,远高于CR-ECO占比。近年来肺炎克雷伯菌的致病性相对较强,感染CR-KPN可导致患者病死率明显增加。研究中160株CRE标本主要分离于痰,其次是引流液、中段尿、血液和分泌物标本。在科室分布方面,前三位分别是重症医学科47株、呼吸内科28株、泌尿外科16株。与尹丹萍等[14]报道数据不尽一致,推断这可能是由于两方研究机构所处地域分布、医院类型、患者年龄、科室分布等不同而导致。160株CRE标本主要来源为痰标本,是CRE菌株的主要来源,与王磊等[11]研究结果一致。痰培养结果可为肺部感染提供病原学依据,目前认为,机械通气、气道切开和呼吸机使用均易诱发肺部感染[15],尤是在重症监护病房,有创伤性的操作会更多,这也是重症监护病房CRE检出率较高的原因[16]。引流液标本分离CRE排在第二位归结于各类手术后深部伤口引起的术后院内感染。而尿液标本中所分离的CRE菌株数排在第三位,泌尿系统感染多和导尿管使用有关,创伤性操作会增加风险。在科室分布中,康复科排第四位,可能是因为康复科患者大部分是老年人,此类人群并发症多,病情比较严重且免疫力低下,需长时间住院治疗,容易导致CRE的产生[17]。CRE的感染来源多样且难以防控,其中病房间的隔离措施不到位、手卫生执行不力等引起的外源性感染或自身肠道携带引起的内源性感染都是发生CRE传播的重要原因,因此在医院感染防治过程中,重视无菌操作及做好安全隔离措施非常关键[18]。另外,临床上对于重点科室或特殊病情的患者应当做好CRE的主动筛查工作,提前预估这些患者感染CRE概率,并相应地做出预防性用药。

本研究结果显示,CRE对氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑林、头孢呋辛、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、美罗培南、亚胺培南、左氧氟沙星、头孢哌酮/舒巴坦和环丙沙星耐药严重,与侯正利等[19]研究结果一致。对庆大霉素和复方磺胺甲噁唑的耐药率到达50.00%,与陈幕等[20]研究结果不完全一致。对阿米卡星的耐药率为30.63%,与程梅等[21]研究结果一致。对替加环素耐药率为2.50%,低于邹凤梅等[22]的研究结果,这些药物敏感试验结果的差异可能是由于本研究分离CRE菌株数尚不够多,也可能由于所检菌株存在一定的地域差异性。

临床常见碳青霉烯酶型有KPC、OXA-48、VIM、IMP、NDM等5种,其中我国常见的是KPC和IMP型[23]。有研究报道,碳青霉烯酶表型可能因地区差异而存在酶型不同[24]。产KPC型碳青霉烯酶72株中CRKP占45株居首位,与张鹏等[25]报道的结果一致。此外,本研究未检测到产OXA-48和VIM型碳青霉烯酶。

综上所述,CRE治疗的抗菌药物有限,且致死率高,临床上仅对替加环素或头孢他啶-阿维巴坦等少数抗菌药物敏感。医院内应该加强产各类CRE,尤其是CR-KPN的耐药监测工作及医院感染管控措施,在确诊感染前做好筛查和预防工作,防止CRE出现严重的院内播散流行。