感染四项阴性献血者去白细胞悬浮红细胞中EB病毒的检测及基因分型

陈秋雨，任慧娟，王颖君，贾高鹏，韩艳秋，

1 内蒙古医科大学附属医院血液科，呼和浩特 010050；2 内蒙古医科大学附属医院检验科；3 内蒙古医科大学附属医院老年医学中心

EB病毒（EBV）是一种直接参与淋巴和上皮肿瘤发生的DNA疱疹病毒，又称人疱疹病毒4型，世界上超过90%的人群普遍易感。EBV感染人体后可快速整合到宿主基因组中，以促进肿瘤发展［1］。早在1997年，EBV就被国际癌症研究机构（IARC）列为Ⅰ类致癌物，每年可致20万癌症患者感染。EBV主要与上皮和淋巴源恶性肿瘤有关，包括鼻咽癌（NPC）、胃癌（GC）、肺淋巴上皮瘤样癌（LELC）、乳腺癌、扁桃体癌、肝癌、恶性唾液腺肿瘤和甲状腺癌、霍奇金淋巴瘤（HL）、非霍奇金淋巴瘤（NHL）等［2］。EBV主要通过唾液传播，并可持续潜伏于人类的B细胞中，故与受感染的人接吻，公用个人物品（如牙刷、餐具或分享食物和饮料）均可致EBV感染。此外，EBV还可感染T淋巴细胞、NK细胞、浆细胞、鳞状细胞、树突状细胞、上皮细胞及平滑肌细胞等［3］，受感染的上皮细胞可在子宫颈或精液中发现，表明EBV有可能通过性接触传播。器官移植和输血也可导致EBV传播。因此，血液制品被认为对输血的受者具有潜在危险，特别是高危个体，包括器官移植和免疫缺陷患者。所以，在输血前筛查EBV核酸基因分型尤其必要。近期，我们收集2023年1月—3月500例临床用血，采用荧光PCR技术进行EBV核酸定量检测，统计其感染率，并对EBV阳性标本进行A/B、F/f、C/D分型，了解临床用血导致EBV感染情况，旨在为今后的预防及治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2023年1月—3月内蒙古呼和浩特地区感染四项筛查结果为阴性的献血者所献去白悬浮红细胞血样，血液样品按照《医疗机构临床用血管理办法》进行处理和储存，从中随机抽取500例，取血袋小辫作为检测样本。

1.2 样本制备及DNA提取 将枸橼酸抗凝的去白悬浮红细胞标本1 mL加入离心管后，再混入等量无菌生理盐水，混匀。取另一离心管，置入1 mL人外周血淋巴细胞分离液。将稀释后的血样加入淋巴细胞分离液中，700 g离心20 min（离心半径7 cm）。根据密度梯度取白色细胞层，该层为单个核细胞层，将其用移液器吸至无菌离心管中，17 000 g离心10 min（离心半径12.5 cm）后取沉淀备用。

1.3 EBV核酸定量 采用RT-PCR法。取2 μL模板DNA加入PCR反应缓冲液中，设立阴、阳性对照及定量标准参考品。置于荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）检测。扩增条件参照试剂说明书。反应程序结束后，观察扩增分析曲线及Ct值。样本Ct值≤26时判断为阳性，根据定量标准曲线计算核酸载量。如果增长曲线不呈S形曲线或Ct值=30，则判定样本中的EBV DNA含量小于检测极限，结果呈阴性。如果增长曲线呈S形曲线且Ct值<30，则判定为EBV DNA结果阳性。

1.4 EBV基因分型检测 采用RT-PCR法。取血袋小辫枸橼酸抗凝全血1 mL，采用天根试剂盒按照说明书提取DNA，将提取的核酸保存到－80 ℃冰箱备用。EBV分型所用引物序列：A/B分型正向引物：5′-AGAAGGGGAGCGTGTGTTGT-3′，反向引物：5′-GGCTCGTTTTTGACGTCGGC-3′；F/f分型正向引物：5′-TCCCACCTGTTACCACATTC-3′，反向引物：5′-GGCAATGGGACGTCTTGTAA-3′；C/D分型正向引物：5′-ACCTGCTACTCTTCGGAAAC-3′，反向引物：5′-TCTGTCACAACCTCACTGTC-3′。PCR反应体系：Taq Plantinum PCR MasterMix 12.5 μL，引物各1 μL，模板DNA 2 μL，加入双蒸水将总体积补足至25 μL。扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共扩增45个循环，最后72 ℃延伸10 min。将A/B、F/f分型和C/D分型的PCR产物与BamHI配成反应体系，30 ℃下孵育1 h，取5 μL PCR扩增产物于加入3%的琼脂糖凝胶（已加入染液）中电泳，凝胶成像系统拍照记录结果。

2 结果

2.1 临床用血的EBV检出情况 500例血液制品样本中有44例检测到有EB病毒DNA拷贝，阳性率为8.8%（44/500）。

2.2 EBV阳性的血制品分型结果 EBV可分为A、B两型，条带为153 bp者为A型（Type A），其检出率为36.36%（16/44），条带为246 bp为B型（Type B），其检出率为63.64%（28/44），而同时出现153 bp和246 bp条带者为A型和B型混合感染（Type A+Type B），本实验中无两型混合感染。EBV阳性的血制品F型检出率为79.55%（35/44），f型的检出率为20.45%（9/44），无两型混合感染。EBV阳性的血制品C型检出率为70.45%（31/44），D型检出率为29.55%（13/44），无两型混合感染。

3 讨论

多数关于包括EBV在内的病毒感染流行病学研究基于血清学检测，而不是基于EBV病毒血清检测。测量血循环中病毒载量能更好地反映感染状况。最近SMATTI等［4］对来自卡塔尔不同民族的673名健康献血者的全血进行EBV DNA检测，结果表明其病毒血症率高达52.6%，病毒载量在0.915~2 585.5拷贝/mL。对不同国家献血者EBV DNA进行检测，其中日本是39.5%，美国是72%，葡萄牙是37.2%，中国是51.4%［5-6］。而本研究中，通过对呼和浩特地区500例去白悬浮红细胞进行EBV DNA检测，统计得出病毒血症率为8.8%，大部分阳性标本的病毒载量处于500～1 000拷贝/mL。可见全血较去白后的悬浮红细胞所含EBV核酸的可能性较大，如果将所献全血直接输注到受血者身体中，则感染EBV的可能性大，即使经过去除白细胞的处理也不能全部将EBV核酸清除，仍有病毒感染风险。

事实上，临床用血中心通过去白的操作从各种血液制品中去除白细胞，减少EBV核酸的数量，防止EBV阳性供体通过输血传播病毒，并保证血液制品的安全性。然而去白的过程虽然减少了血制品的病毒载量，但并没有消除通过血液制品传播EBV的风险，因为病毒仍可在白细胞减少的血液中检测到。因此，血液制品被认为对输血者仍有潜在危险，尤其是器官移植和免疫功能低下者［7］。本实验中对已经去白细胞处理的悬浮红细胞标本进行检测，仍可检出有EBV核酸存在，如果该血制品被输注到受血者体内，则被感染EBV的可能性增大。

EBV感染宿主可通过唾液传播，少数经输血和器官移植途径进入体内。EBV基因组由线性双链DNA组成，基因组大小为168~184 kbp，编码约85个基因［8］。EB病毒感染后的B淋巴细胞表达6种核蛋白（EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、EBNA2LP），3种膜蛋白（LMP1、LMP2A、LMP2B）及两种小的非聚腺苷酰化的RNA（ENER1、EBER2）［9］。EBV可分为A型和B型，这两种基因型基于EBNA-2基因的差异区分［10］。

EBV类型在世界范围内出现，但地理分布不同。如A型在来自欧洲、美洲、中国和南亚的人群中普遍存在，而B型在非洲和巴布亚新几内亚人群中更常见［11］。免疫受损患者更容易获得这两种类型。最近对卡塔尔健康献血者进行的一项研究中报告了A型（72.5%）与B型（3.5%）相比占优势，并且在4%的样本中检测到两种基因型的混合感染［4］。CORREA等［12］对阿根廷的EBV无症状携带者进行研究发现，A型EBV感染占75.9%，B型占14.6%，并且两种类型的共感染占6.5%。不同的EBV类型在转化能力上不同，体外实验显示A型比B型更容易转化B淋巴细胞，可能与B型EBV感染的淋巴母细胞样细胞系中较低水平的 LMP1表达有关，且当重组B型病毒获得A型EBNA-2A基因时，它获得了A型病毒的转化能力。在EBV感染人源化小鼠后，A型与B型产生淋巴瘤的比率相似，但感染B型EBV毒株的B细胞具有更多的裂解蛋白表达和EBV转化的淋巴母细胞样细胞系［13］。在MONTEIRO等［14］进行的一项回顾性研究中，B型EBV感染的临床病程比A型EBV更长，平均发热持续时间为17.6 d（1~90 d），而A型EBV的平均发热时间为14.8 d（1~30 d）。与感染B型EBV 或同时感染A型和B型EBV的患者相比，年龄在14岁及以上的A型EBV感染患者的肝酶平均水平更高。本研究中，在500名呼和浩特地区的临床用血中检测到EBV的标本中，测得A型感染率为36.36%（16/44），B型感染率为63.64%（28/44）。通过与其他国家比较可知，无论有无症状的被调查者均以A型为主，本实验结果以B型感染为主，与其他国家的报告有所差别。44例EBV DNA阳性的去白悬浮红细胞标本中以BCF型EBV感染为主；张小团［15］对湖南部份地区疑似EBV感染儿童的咽拭子进行检测，结果以ACF型为主。

本研究中，健康人群仍以F型为主要流行类型。与基因型F的情况一样，中国和非洲的鼻咽癌患者EBV感染以C基因型为主，检出率几乎为100%，美国和韩国的鼻咽癌患者血液中仅发现EBV基因型D，而在斯洛文尼亚鼻咽癌患者中EBV基因型C和基因型D均可检出［16］。研究表明，ADF型是乳腺癌患者最普遍的EBV基因型组合［17］。本研究中呼和浩特地区临床用血所感染的EBV以BCF型为主，与报道结果有所差异，提示EBV基因变异与疾病相关。

综上所述，感染四项阴性献血者输血时有EBV感染的可能，EBV阳性样本中，多以B、C、F型为主。