eptA过表达介导的临床分离的鲍曼不动杆菌多黏菌素耐药研究

叶秀芬?俞容?周益琴

摘要：目的 为了确定鲍曼不动杆菌除PmrCAB以外的多黏菌素耐药机制。方法 收集2020年金华市人民医院住院患者痰液标本分离的3株鲍曼不动杆菌（AB1、AB2和AB3）。微量肉汤稀释法测定3株鲍曼不动杆菌对亚胺培南、美罗培南和多黏菌素的最低抑菌浓度。通过PCR明确菌株是否携带eptA并进一步对操纵子pmrCAB进行分析，明确是否存在氨基酸突变。全基因组测序分析菌株的ST型、耐药基因以及eptA的上游结构。使用荧光定量PCR技术检测多黏菌素耐药相关基因pmrB以及eptA基因的表达量。GraphPad Prism 8.0用于数据分析。结果 3株鲍曼不动杆菌对多黏菌素耐药，MIC=16 μg/mL。根据Pasteur分型，它们都属于ST2；根据Oxford分析，AB1和AB3属于ST208，AB2属于ST1806。3株鲍曼不动杆菌都携带blaOXA-23碳青霉烯酶耐药基因，但都不存在PmrCAB氨基酸突变。表达量分析显示3株菌存在eptA过表达（P<0.01）。ISAba1的插入位点分别在eptA起始密码子之前第13和18个碱基处。然而，pmrCAB表达量改变差异无统计学意义（P>0.05）。结论 ISAba1插入介导的eptA的过表达可能是新的鲍曼不动杆菌多黏菌素耐药机制之一。

关键词：鲍曼不动杆菌；耐药；多黏菌素；eptA

中图分类号：R978.1文献标志码：A

Study on polymyxin resistance mediated by eptA overexpression in Acinetobacter baumannii clinical isolates

Ye Xiu-fen， Yu Rong， and Zhou Yi-qin

（Department of Clinical Laboratory， Jinhua Peoples Hospital， Jinhua 321000）

Abstract Objective To determine the polymyxin resistance mechanism in Acinetobacter baumannii （A. baumannii） other than PmrCAB. Methods Three A. baumannii clinical strains collected from sputum were selected in 2020. Minimal inhibitory concentrations （MICs） of imipenem， meropenem and colistin were tested by the broth micro-dilution method. PCR was conducted to test whether the strains carried eptA and further analyzed the pmrCAB mutation.  The ST type， drug resistance gene， and the upstream structure of eptA of the strain were analyzed using whole-genome sequencing. Real-time quantitative PCR （qRT-PCR） was used to detect the expression of polymyxin resistance-related genes pmrB and eptA. Experimental data were analyzed using GraphPad Prism 8.0. Results Three A. baumannii strains were resistant to polymyxin， and MICs were all 16 μg/mL. According to the Pasteur type， they all belonged to ST2; according to Oxford type， AB1 and AB3 belonged to ST208， and AB2 belonged to ST1806. Three strains all carried the blaOXA-23 carbapenemase resistance gene， but none of them had PmrCAB amino acid mutations. Expression analysis showed that the three strains had overexpression of eptA （P<0.01）. The insertion sites of ISAba1 were 13 and 18 bases before the eptA start codon， respectively. However， there was no statistically significant difference in the expression of pmrCAB （P>0.05）. Conclusion The overexpression of eptA mediated by the insertion of ISAba1 may be one of the new polymyxin resistance mechanisms in A. baumannii.

Key words Acinetobacter baumannii; Resistance; Polymyxin; eptA

鮑曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）可引起各种医院相关感染。在过去的几十年中，由于大多数可用抗菌药物的耐药菌株出现及扩散已经促使临床医生转向多黏菌素作为治疗的最终方案[1]。由于多黏菌素的使用量增加，导致其耐药性逐渐增加，特别是碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌（carbapenem-resistant A. baumannii， CRAB）[2]。因此，明确是否有除常见的PmrCAB氨基酸突变介导的多黏菌素耐药外的新机制对临床用药和CRAB治疗至关重要。

1 材料与方法

1.1 实验材料

3株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌（CRAB）（AB1，AB2和AB3）分离自2020年金华市人民医院住院患者痰液标本，质控菌株大肠埃希菌ATCC25922；亚胺培南（1.0 g，国药准字H20084019，大连美仑生物技术有限公司）、美罗培南（0.5 g，国药准字H20093466，上海上药新亚药业有限公司）；多黏菌素（1.0 g，美国Sigma公司）；MH肉汤（英国Oxoid公司）；比浊仪（法国Merieux公司）；荧光定量PCR仪（美国Thermo公司）。

1.2 碳青霉烯类药物和多黏菌素敏感性试验

采用微量肉汤稀释法测定3株鲍曼不动杆菌对亚胺培南、美罗培南和多黏菌素的最低抑菌浓度。药敏结果根据美国临床和实验室标准化协会CLSI 2020标准判读。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

1.3 DNA扩增检测耐药相关基因突变情况

用DNA提取试剂盒提取细菌DNA。对eptA基因进行PCR，引物序列如表1所示[3-4]，主要步骤如下：配置PCR反应体系（10×PCR Buffer，Mg2+，dNTP Mixture，上游引物，下游引物，rTaq酶，无菌双蒸水，DNA模板）。PCR反应过程如下：预变性（94℃，5 min），变性（94℃，30 s），退火（55℃，30 s），延伸（根据引物长度，1000 bp/min），最后延伸（72℃，7 min），同时设置1个阳性对照、一个阴性对照以及不加DNA的空白对照。PCR产物琼脂糖凝胶电泳及观察。选取与目的大小片段相符的阳性产物送上海华大基因公司测序，测序结果再在NCBI数据库进行BLAST序列比对分析。

1.4 全基因组测序以及eptA基因上游结构分析

对3株CRAB进行全基因组测序。首先，使用试剂盒提取细菌总DNA后送公司进行测序。通过使用CLC Genomics Workbench 10.1.1对序列进行拼接，并通过序列比对分析eptA基因的上游结构。

1.5 qRT-PCR检测多黏菌素耐药相关基因表达量的变化

使用荧光定量PCR技术检测多黏菌素耐药相关基因pmrB以及eptA基因的表达量。所用引物详见表2[5]。结果采用2-ΔΔCt方法，菌株ATCC19606为参考菌株，rpoB为内参基因。以eptA基因为例，如下所示：ΔCt（试验样本）=Ct（试验样本eptA基因）-Ct（试验样本rpoB基因），ΔCt（校准样本）=Ct（ATCC19606 eptA基因）-Ct（ATCC19606 rpoB基因），-ΔΔCt=ΔCt（校准样本）-ΔCt（试验样本），2-ΔΔCt即为eptA的表达量。

1.6 统计学方法

GraphPad Prism 8.0对数据进行统计学分析及图片绘制，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药敏结果

AB1，AB2，AB3对亚胺培南和美罗培南均耐药，MIC均≥64 μg/mL，且均对多黏菌素耐药，MIC=16 μg/mL，具体结果见表3。

2.2 ST型、耐药基因以及常见多黏菌素耐药基因突变情况

通过分析3株菌的耐药基因，发现这3株菌都携带blaOXA-23碳青霉烯酶耐药基因，此外还携带β-内酰胺类（blaADC-52，blaADC-176和blaOXA-51）、氨基糖苷类（armA，aph（3）-VI）以及大環内酯类[msr（E），mph（E）]耐药基因。根据Pasteur分型，它们都属于ST2；根据Oxford分析，AB1和AB3属于ST208，AB2属于ST1806。此外，与多黏菌素耐药相关的基因pmrA、pmrB和pmrC没有氨基酸突变（表4）。

2.3 eptA基因上游结构分析

通过全基因组测序进一步分析eptA基因上游结构。结果显示：AB1和AB2在上游13个碱基处有一个ISAba1，而AB3在上游18个碱基处有一个ISAba1。其余的结构相同。具体结果见图1。

2.4 多黏菌素耐药相关基因表达量变化

进一步对鲍曼不动杆菌多黏菌素耐药相关基因的表达量进行了分析。结果显示，eptA的表达量可增加4～7倍，差异具有非常统计学意义（P＜0.01）。然而，染色体上的其他多黏菌素耐药相关基因pmrB和pmrC的表达量无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。具体结果详见图2。

3讨论

CRAB对多黏菌素的耐药率越来越高，已成为许多临床医生面临的主要挑战[6-7]。研究表明，鲍曼不动杆菌对多黏菌素的耐药性主要依赖于LOS促修饰酶，从而使抗菌药物与细菌初次接触后，细菌表面的净负电荷减少，双组分系统PmrAB的突变激活是主要的多黏菌素耐药机制，其可导致磷酸乙醇胺（pEtN）转移酶PmrC过表达进而导致多黏菌素耐药[8-9]。PmrCAB介导的多黏菌素耐药机制已经完全明确，而是否存在新的耐药机制有待进一步研究。

最近有研究发现在编码H-NS相关转录调节因子的基因中插入ISAba125元件有助于鲍曼不动杆菌临床菌株产生高水平多黏菌素耐药性[10]。这种插入触发了远端基因的表达，该基因为eptA，其产物与PmrC具有93%的同源性，且与PmrC一样可介导pEtN转移酶活性[11]。因此，研究eptA基因是否可以介导多黏菌素耐药意义重大。

eptA基因在鲍曼不动杆菌分离株中很常见。在法国NRC-AR分析的32株黏菌素敏感菌株中，27株（84%）分离株eptA阳性，但它们都没有携带基因上游的ISAba1序列[12-13]。Lesho等[10]在116株鲍曼不动杆菌菌株中检测到20%菌株除pmrC外还存在eptA同源物。本研究中，发现3株多黏菌素耐药鲍曼不动杆菌存在pmrC同系物eptA过表达，这可能是由于上游插入ISAba1导致。ISAba1是一种在鲍曼不动杆菌基因组中普遍存在的遗传元件[14-15]，它可以为下游基因提供一个强的启动子，进而使下游基因表达量增加，从而导致多黏菌素耐药，对eptA表达量的分析结果也进一步证实了这一点。在研究的分离株中，通过不同的遗传事件，ISAba1的插入发生在eptA上游的不同位置（13和18 bp）。然而，eptA的表达水平与ISAba1和eptA转录起始之间的距离无关。在此次研究菌株中，在eptA上游插入ISAba1构成了一种更直接的eptA激活方式，其导致的多黏菌素MIC可以直接达到耐药水平。由于鲍曼不动杆菌中ISAba1和eptA基因相当普遍，因此在反复进行多黏菌素治疗的压力下，由随机插入事件引起多黏菌素耐药的现象时常发生。

总之，本研究表明CRAB对多黏菌素耐药机制的复杂性和多样性，提出了ISAba1和eptA共同作用下介导的多黏菌素耐药机制，为进一步研究CRAB对多黏菌素耐药提供依据。

参 考 文 献

Carrasco L D M， Dabul A N G， Boralli C， et al. Polymyxin resistance among XDR ST1 carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clone expanding in a teaching hospital[J]. Front Microbiol， 2021， 12： 622704.

Trebosc V， Gartenmann S， Totzl M， et al. Dissecting colistin resistance mechanisms in extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii clinical isolates[J]. mBio， 2019， 10（4）： e01083-19.

Xu F， Hinenoya A， Zeng X， et al. Critical role of 3'-downstream region of pmrB in polymyxin resistance in Escherichia coli BL21（DE3）[J]. Microorganisms， 2021， 9（3）： 655.

Ilsan N A， Lee Y J， Kuo S C， et al. Antimicrobial resistance mechanisms and virulence of colistin-and carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii isolated from a teaching hospital in Taiwan[J]. Microorganisms， 2021， 9（6）：1295.

Kim M， Park J， Park W. Genomic and phenotypic analyses of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii NCCP 16007 isolated from a patient with a urinary tract infection[J]. Virulence 2021， 12（1）： 150-164.

Yoon E J， Kim H S， Woo H， et al. Trajectory of genetic alterations associated with colistin resistance in Acinetobacter baumannii during an in-hospital outbreak of infection[J]. J Antimicrob Chemother， 2021， 77（1）： 69-73.

Piperaki E T， Tzouvelekis L S， Miriagou V， et al. Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii： In pursuit of an effective treatment[J]. Clin Microbiol Infect， 2019， 25（8）：951-957.

Nodari C S， Fuchs S A， Xanthopoulou K， et al. pmrCAB recombination events among colistin-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii clinical isolates belonging to international clone 7[J]. mSphere， 2021： e0074621.

Lima W G， Alves M C， Cruz W S， et al. Chromosomally encoded and plasmid-mediated polymyxins resistance in Acinetobacter baumannii： A huge public health threat[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 2018， 37（6）：1009-1019.

Lesho E， Yoon E J， McGann P， et al. Emergence of colistin-resistance in extremely drug-resistant Acinetobacter baumannii containing a novel pmrCAB operon during colistin therapy of wound infections[J]. J Infect Dis， 2013， 208（7）： 1142-1151.

Deveson L D， Crane B， Wright A， et al. Emergence of high-level colistin resistance in an Acinetobacter baumannii clinical isolate mediated by inactivation of the global regulator H-NS[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2018， 62（7）： e02442-17.

Gerson S， Lucassen K， Wille J， et al. Diversity of amino acid substitutions in PmrCAB associated with colistin resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii[J]. Int J Antimicrob Agents， 2020， 55（3）： 105862.

Gerson S， Betts JW， Luca?en K， et al. Investigation of novel pmrB and eptA mutations in isogenic Acinetobacter baumannii isolates associated with colistin resistance and increased virulence In vivo[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2019， 63（3）： e01586-18.

Agoba E E， Govinden U， Peer A K C， et al. ISAba1 regulated OXA-23 carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii strains in durban， South Africa[J]. Microb Drug Resis， 2018， 24（9）： 1289-1295.

付啟云， 郑绍同， 连建春， 等. 耐药鲍曼不动杆菌不同年份分离株耐药元件基因比较研究[J]. 中国抗生素杂志， 2019， 44（5）： 595-599.