基于响应面法和人工神经网络优化复合乳酸菌发酵蓝莓汁产胞外多糖工艺

龚敏慧，单成俊，李双健，杨素群，王 英，刘小莉，周剑忠,

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013；2.江苏省农业科学研究院农产品加工研究所，江苏南京 210014）

乳酸菌是革兰氏阳性菌，具有调节肠道菌群平衡、提高免疫功能、抗氧化等益生特性[1]。胞外多糖（exocytopolysaccharid，EPS）是乳酸菌发酵产生的一种高附加值产品，一般由L-岩藻糖、D-葡萄糖、D-氨基葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖和L-鼠李糖通过糖苷键组成。研究表明，乳酸菌中的EPS 具有多种生物学功能，包括抗肿瘤、抗溃疡活性、抗病毒和降低胆固醇等[2]，广泛应用于制药和食品工业[3]。

乳酸菌EPS 含量通常受发酵工艺的影响，例如初始pH、接种量、发酵温度和发酵时间等[4]。目前，EPS 发酵工艺优化通常采用传统的单因素法[5]、响应面法（RSM）[6]、正交试验[4]等多种优化方法。传统的单因素法既费力又耗时，而且往往忽略了影响因素之间相互作用的影响。RSM 在过程和产品改进中得到了广泛而有效的应用，常被用于实验设计、模型开发等操作变量的检查和优化[7]。尽管RSM 等统计方法已被证明比单因素法更有效，但它们有一定的局限性，即参数和级别的数量是有限的。为了克服这些问题，基于人工智能的优化方法如人工神经网络（ANN）和遗传算法（GA）得到发展。ANN 是一种强大的建模技术，与传统建模技术相比，它可以在不考虑现象学机制本质的前提下建模，理解问题背后的数学背景，并能够直接从一组示例中学习变量之间的线性和非线性关系[8]。ANN 可以单独使用，也可以与其他方法如RSM 或GA 相结合。Gadekar等[9]使用了RSM-ANN 联合方法来增强染料去除效果，Gammoudi 等[10]利用RSM、ANN-GA 和Simulink 模型相结合来提高突尼斯辣椒中辣椒素的提取量。类似地，RSM-ANN 方法已被用于乳酸菌EPS 的提取及优化[11]，但是在优化发酵果蔬汁中EPS 含量的研究尚未报道。

蓝莓汁富含多种营养成分，如多糖、氨基酸、维生素等，以蓝莓汁为发酵基质可以很好地促进乳酸菌的生长，同时乳酸菌发酵可以提高蓝莓汁的营养价值和风味[12]。目前，乳酸菌发酵蓝莓汁常以活菌数为指标，鲜以EPS 含量为指标的研究。本研究以蓝莓为原料，采用实验室已筛选得到的三株高产胞外多糖乳酸菌进行发酵，以EPS 含量为指标，利用单因素法和Box-Behnken（BB）试验筛选得到关键因素，采用ANN-GA 建立神经网络模型，得到最佳发酵工艺条件，提高乳酸菌发酵蓝莓汁中的EPS 含量，为开发新型蓝莓汁饮料提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南高丛蓝莓冻果 南京双吉农业发展有限公司提供；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）9sh、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）SR2-6、柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）GM11 江苏省农业科学院农产品加工研究所食品生物工程研究室筛选保藏；碳酸氢钠、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、大豆肽、玉米低聚肽、胶原蛋白肽、酪蛋白磷酸肽、乳清蛋白粉 浙江诺一有限公司提供；MRS 肉汤培养基 北京奥博星生物技术有限公司；浓硫酸 南京化学试剂股份有限公司；苯酚、无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司。

3K15 离心机 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；酶标仪TG600 云铂仪器成都有限公司；LRH-150 生化培养箱、 DHG-9023A 烘箱 上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-1C 型双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；榨汁机 广东德玛仕智能厨房设备有限公司；HH-4 恒温水浴锅 常州国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 种子液的制备 将植物乳杆菌9sh、发酵乳杆菌SR2-6 和柠檬明串珠菌GM11 于MRS 固体培养基上37 ℃活化48 h，挑取单菌落接种到MRS 液体培养基中，37 ℃培养24 h，在4000 r/min 条件下离心10 min 去上清液，用无菌水洗涤沉淀、离心，重复2～3 次，用无菌水重悬，使菌密度达到1.0×107CFU/mL。

1.2.2 蓝莓汁的制备 将冷冻蓝莓在室温解冻，打浆，在4500 r/min 条件下离心15 min，40 目滤布过滤得到蓝莓汁，用0.1 mol/L 碳酸氢钠调节pH 至4.5，加入6%（w/v）的蔗糖和0.6%（w/v）的大豆肽进行调配，搅拌均匀，85 ℃巴氏杀菌25 min，待其冷却后接入6%（v/v）的种子液，菌种比例为1:1:1，37 ℃静置培养48 h，于4 ℃放置2 h 以停止发酵。

1.2.3 发酵工艺优化单因素实验 参考曹桢[13]的方法对发酵工艺进行单因素实验。在1.2.2 的基础上，以EPS 含量和活菌数为检测指标，考察植物乳杆菌9sh、发酵乳杆菌SR2-6 和柠檬明串珠菌GM11 的菌种比例（1:0:0、0:1:0、0:0:1、1:1:0、1:0:1、0:1:1、 1:1:1、 2:1:1、 1:2:1、 1:1:2、 2:2:1、2:1:2、1:2:2），碳源种类（蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖），碳源添加量（0%、2%、4%、6%、8%、10%），氮源种类（大豆肽、玉米低聚肽、胶原蛋白肽、酪蛋白磷酸肽、乳清蛋白粉），氮源添加量（0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%），初始pH（原始 pH2.8、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0），接种量（2%、4%、6%、8%、10%），发酵温度（28、30、32、34、36、38 ℃），发酵时间（12、24、36、48、60、72 h）对发酵蓝莓汁的影响，确定最佳单因素水平。

1.2.4 发酵工艺优化响应面试验 基于单因素实验结果，利用BB 试验设计，以EPS 含量为响应值，选择影响最大的四个因素：初始pH（A）、接种量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）为自变量。响应面试验因子水平编码见表1。

1.2.5 人工神经网络建模 在响应面试验的基础上，通过MATLAB 软件建立BP 神经网络模型，对EPS含量进行预测。该模型使用具有双曲正切sigmoid传递函数和线性传递函数的前馈网络，结合Levenberg-Marquartd 反向传播算法进行测试。将样本随机分为训练、验证和测试，分别占数据的70%、15%和15%。输入层有4 个神经元 [初始pH（A），接种量（B），发酵温度（C），发酵时间（D）]，输出层有一个神经元[EPS 含量（Y）]。初始层与网络的输入相连，输入数据通过生成随机权重映射到隐藏层。通过前向计算和权重矩阵生成，隐藏层将数据映射到输出层，得到预测值。通过计算预测值与真实值的误差，如果误差没有达到设定的神经网络训练误差极限，则重复上述过程。经过反复训练，当预测值与真实值的误差达到误差极限或达到设定的训练次数时，神经网络训练将终止。训练的最大epoch 数为1000，学习率为0.01，训练目标的最小误差为0.00001。隐藏神经元的数量通过反复实验而变化，直到网络在训练后表现最佳，得到BP 神经网络模型，最后利用GA 求解该模型的最优值。均方误差（MSE）是输出和目标之间的平均平方差，MSE 值越低越好。回归R值衡量了产出和目标之间的相关性，R值为1 表示密切关系，0 表示随机关系。

1.2.6 指标测定方法

1.2.6.1 EPS 含量的测定 参考戴意强等[14]的方法测定EPS 含量。将发酵蓝莓汁在4000 r/min 条件下离心10 min，取1.0 mL 上清液置于10 mL 离心管中，加入9.0 mL 无水乙醇，混合均匀后于4 ℃静置过夜，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用80%乙醇洗涤、离心2～3 次，加入5.0 mL 去离子水溶解得到粗EPS 溶液。采用苯酚-硫酸法测定EPS 含量。

将葡萄糖于105 ℃干燥箱中烘干至恒重，称取10 mg 置于100 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度摇匀，配置成0.1 mg/mL 的葡萄糖标准溶液。分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 于具塞试管中，用去离子水补齐至1.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL 浓硫酸，混匀后于37 ℃下静置20 min，并于490 nm 下测定吸光度。以葡萄糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，得到葡萄糖标准曲线：y=0.0048x+0.0855（R2=0.9983）。根据葡萄糖标准曲线计算发酵蓝莓汁中的EPS 含量。

1.2.6.2 活菌数的测定 根据GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》[15]中的方法检测发酵蓝莓汁中的活菌数。

1.3 数据处理

所有实验重复3 次，结果用平均值±标准差表示。采用Excel 和Origin 2021 对单因素实验结果进行分析并作图；采用Design Expert 8.0.6 进行响应面试验设计及数据分析；采用SPSS 26.0 进行差异显著性分析；采用MATLAB 软件建立人工神经网络模型。

2 结果与分析

2.1 发酵工艺优化单因素实验结果

2.1.1 菌种比例对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响 菌种比例对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响如图1 所示。植物乳杆菌9sh、发酵乳杆菌SR2-6、柠檬明串珠菌GM11 在蓝莓汁中混合发酵所产生的EPS 含量和活菌数高于单独发酵产生的EPS 含量和活菌数，表明三种乳酸菌可以进行混合发酵。混合发酵时，发酵乳杆菌SR2-6 比例过高（1:2:1、2:2:1、1:2:2）或柠檬明串珠菌GM11 比例过高（1:1:2、2:1:2、1:2:2）时，均会出现发酵不足、糖代谢不充分的问题，原因是SR2-6 和GM11 为异型发酵乳酸菌，延滞期短，能迅速繁殖产生乳酸等物质，降低环境的pH；9sh 为同型发酵菌种，发酵后期乳酸浓度继续增高，大部分乳酸菌的活动逐渐受到抑制，而耐酸性较强的9sh 成为优势菌，继续发酵[16]。当植物乳杆菌9sh、发酵乳杆菌SR2-6、柠檬明串珠菌GM11 的比例为2:1:1 时，菌种生长旺盛，达到1.75×109CFU/mL，高于其他实验组，此时蓝莓汁中的EPS 含量最高，为1.736 g/L，原因可能是植物乳杆菌9sh 所占比例最高，而植物乳杆菌是从植物中分离纯化得到的，更能适应蓝莓汁的生长环境[17]，充分利用碳氮源产生EPS。

图1 菌种比例对发酵蓝莓汁中EPS 和活菌数的影响Fig.1 Effects of strain ratio on EPS and number of viable count in fermented blueberry juice

2.1.2 碳源种类和添加量对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响 碳源是乳酸菌生长繁殖过程中必不可少的营养物质，其种类和含量影响EPS 的合成[18]。碳源种类和添加量对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响见图2。

图2 碳源种类（a）和添加量（b）对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响Fig.2 Effects of carbon source types (a) and additive amount(b) on EPS content and number of viable count in fermented blueberry juice

由图2a 可知，与空白对照组相比，四个实验组发酵后产生的EPS 含量均升高，但葡萄糖作为碳源时，其EPS 含量仅略高于空白对照组，这是因为乳酸菌利用葡萄糖的过程中会产生大量的有机酸，使得pH 迅速下降，而pH 发生变化不利于EPS 的积累[19]；此外，五个实验组的活菌数均在1.0×109CFU/mL以上，其中蔗糖、葡萄糖、麦芽糖的活菌数低于对照组，可能是因为补充蔗糖、葡萄糖、麦芽糖对这三株乳酸菌的生长没有促进作用。当乳糖为补充碳源时EPS 含量最高，为2.385 g/L，其次是蔗糖、麦芽糖和葡萄糖，可能是因为三种乳酸菌利用乳糖的效果较好，故选择乳糖作为蓝莓果汁的补充碳源。

由图2b 可知，随着乳糖添加量的增加，EPS 含量和活菌数均呈现先升后降的趋势，且在6%时达到峰值，EPS 含量为2.392 g/L。当乳糖添加量增加到10%时，EPS 含量不存在显著性差异（P＞0.05），这是由于较低添加量的乳糖可以促进乳酸菌的生长代谢，较高添加量的乳糖会改变乳酸菌的细胞渗透压，从而抑制EPS 的合成[20]，因此选择乳糖添加量为6%。

2.1.3 氮源种类和添加量对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响 氮源是乳酸菌所需的六大营养素之一，由于乳酸菌自身不能合成蛋白质，只能利用环境中的蛋白质以满足生长的需要，因此在蓝莓果汁中补充氮源是必要的[17]。氮源种类和添加量对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响见图3。

图3 氮源种类（a）和添加量（b）对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响Fig.3 Effects of nitrogen source types (a) and additive amount(b) on EPS content and number of viable count in fermented blueberry juice

如图3a 所示，不同氮源种类对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数有显著影响（P＜0.05），且两者变化趋势一致，表明EPS 的合成与发酵菌株的生长情况有一定的关系，其中玉米低聚肽与对照组差异不明显，可能是因为玉米低聚肽在蓝莓汁中的溶解性差，乳酸菌可利用的营养成分较其他组少，故影响EPS 的合成[21]；乳清蛋白粉的活菌数与对照组接近，原因是乳清蛋白粉对乳酸菌的生长没有作用，但可以促进EPS 的合成。添加大豆肽和胶原蛋白肽的发酵蓝莓汁中分别产生2.448 g/L 和2.313 g/L 的EPS 含量，显著高于其它氮源（P＜0.05），可能原因是这三种乳酸菌可以较好地分解利用大豆肽和胶原蛋白肽以合成更多的EPS，且与胶原蛋白肽相比，大豆肽含有大量易于被人体吸收的小分子量的低聚肽，使其具有更好的低变应原[22]，因此选择大豆肽作为补充氮源。

如图3b 所示，随着大豆肽添加量的增加，发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数均呈现先升后降的趋势，当大豆肽添加量过低时，细胞合成乳酸菌生长繁殖时所需的蛋白质、核酸等受到影响，进而影响产糖量[23]；当大豆肽添加量过高时，发酵液粘稠，溶氧量减小，导致菌株产糖的分泌与合成受到影响[24]。当大豆肽添加量为0.6%时EPS 含量最高，为2.394 g/L，因此选择大豆肽添加量为0.6%。

2.1.4 初始pH 对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响 初始pH 对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响见图4。由图4 可知，随着初始pH 的增加，发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数均呈现先升后降的趋势，这一结果与李春雨等[25]的研究一致，原因是pH 过高会使乳酸菌在生长过程中产生大量的乳酸和酶类，使蓝莓汁的pH 迅速下降，不利于乳酸菌的生长，且分泌的酶类对EPS 有降解作用[26]；pH 过低会使脂中间体异戊二烯脂的运载活性受阻，从而抑制EPS 的合成[27]。当初始pH 为4.5 时EPS 含量达到最大，为2.513 g/L，因此选择初始pH 为4.5。

图4 初始pH 对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响Fig.4 Effect of initial pH values on EPS content and number of viable count in fermented blueberry juice

2.1.5 复合发酵菌种接种量对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响 复合发酵菌种接种量对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响见图5。由图5 可知，接种量对EPS 含量和活菌数有显著影响（P＜0.05），EPS 含量随着接种量的增加呈现先升后降的趋势，主要由于接种量较低时乳酸菌生长比较活跃，当接种量超过8%时活菌数趋于平稳，蓝莓汁生长环境中的营养物质减少，EPS 的积累受到限制[28]。当接种量为8%时EPS 含量达到最大，为2.557 g/L，因此选择接种量为8%。

图5 复合发酵菌种接种量对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响Fig.5 Effects of inoculation amount of compound fermentation cultures on EPS content and number of viable count in fermented blueberry juice

2.1.6 发酵温度对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响 发酵温度是影响乳酸菌生长繁殖的一个重要因素，发酵温度对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响见图6。由图6 所示，当发酵温度小于30 ℃时，EPS 含量随发酵温度的升高而增大，原因是发酵温度过低时乳酸菌生长缓慢，不利于其生长代谢[25]；当发酵温度在30～34 ℃之间时，EPS 含量差异不显著；当发酵温度大于34 ℃时，EPS 含量降低，因为提高发酵温度会使乳酸菌体内的酶失活，减少EPS 含量的合成[29]。因此从考虑成本的角度出发，选择发酵温度为30 ℃，此结果与邢瀚文[30]报道一致。

图6 发酵温度对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响Fig.6 Effect of fermentation temperature on EPS content and number of viable count in fermented blueberry juice

2.1.7 发酵时间对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响 发酵时间对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响见图7。由图7 所示，六个实验组的活菌数均在1.0×109CFU/mL 以上，EPS 含量随发酵时间的延长而增大，原因是乳酸菌处于生长旺盛期，EPS 含量逐渐积累；当乳酸菌发酵到60 h 时EPS 含量达到最大，为2.736 g/L，此时乳酸菌进入稳定期，活菌数保持动态平衡；发酵后期，乳酸菌进入衰亡期，此时蓝莓果汁中pH 降低，蓝莓果汁中的碳氮源大量减少，代谢废物增加，同时乳酸菌代谢过程中产生的糖基水解酶会降解EPS，使EPS 含量降低[31]。综上所述，选择发酵时间为60 h。

图7 发酵时间对发酵蓝莓汁中EPS 含量和活菌数的影响Fig.7 Effect of fermentation time on EPS content and number of viable count in fermented blueberry juice

2.2 响应面试验优化结果

响应面试验设计及结果如表2 所示。对表2 试验结果进行回归分析，建立EPS 含量（Y）对初始pH（A）、接种量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）的回归模型，得到二次多项回归方程为：

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiments

由表3 可知，回归模型的F值=45.16，P值＜0.0001，说明该模型极其显著（P＜0.01），具有统计学意义；失拟项的P值=0.8423＞0.05，且决定系数R2=0.9242，调整决定系数R2Adj=0.8485，说明失拟项检验不显著。调整决定系数R2Adj与决定系数R2值稍远，这表明在设计或结果中存在噪声[32]。从回归模型中各项P值可知，B、BC、A2、B2、C2、D2对EPS含量的影响极显著（P＜0.01），A、C、AC 对EPS 含量的影响显著（P＜0.05），D、AB、AD、BD、CD 对EPS含量的影响不显著，且各因素对EPS 含量的影响顺序为：接种量＞发酵温度＞初始pH＞发酵时间。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

各因素交互作用对EPS 含量影响的响应面图见图8，通过响应面图可以反应各因素对EPS 含量的影响[33]。如果响应面的曲线越陡峭，则表示该因素对EPS 含量的影响越大，反之则表示影响越小[34]。由图8 可知，接种量对EPS 含量的影响最大，与表3方差分析结果一致。文献[35]报道表明，ANN 在数据建模方面优于RSM，故进一步用ANN-GA 对获得的数据进行建模。

2.3 人工神经网络优化结果

通过使用ANN-GA 进一步优化RSM 中获得的数据，以获得更高的EPS 含量。采用具有误差反向传播的前馈神经网络对数据进行建模，并使用遗传算法获得所选参数的最佳条件。选定的四个变量被选为输入层的输入神经元，EPS 含量被选为输出层的输出神经元。图9 显示了构建的神经网络的拓扑结构。

图9 EPS 含量构建网络的拓扑结构Fig.9 Topology of a constructed network for EPS content

利用BP 神经网络对BB 试验结果进行分析，得到人工神经网络模型均方误差图和模拟仿真效果图，见图10、图11。

图10 人工神经网络模型均方误差效果图Fig.10 Mean square error of artificial neural network model

图11 人工神经网络模拟仿真效果图Fig.11 Simulation effect of artificial neural network

如图10、图11 所示，当迭代次数为10 时，BP 神经网络训练结束，此时训练集均方误差为0.025043，训练、验证和测试数据的R值分别为0.96991、0.97647 和0.97452，总体R值为0.9343，表明拟合良好。通过遗传算法求解该模型的最优值，得到最佳发酵工艺条件为初始pH4.53，接种量7.89%，发酵温度30.08 ℃，发酵时间60.11 h，此时EPS 含量达到3.565 g/L。考虑到实验的实际操作性，将最佳发酵工艺条件调整为初始pH4.5，接种量8.0%，发酵温度30 ℃，发酵时间60 h。在此条件下进行3 次验证实验，得到EPS 含量实际值为3.537 g/L，与预测值相比基本一致，可见BP 神经网络的模型合理、准确性高[35]。因此采用RSM-ANN 优化发酵蓝莓汁提高EPS 含量的工艺条件准确可靠，可用于以后的乳酸菌发酵蓝莓汁提高EPS 含量的研究中。

3 结论

本研究采用单因素法对菌种比例、碳氮源种类及添加量、初始pH、接种量、发酵温度和发酵时间进行优化，选择四个主要因素：初始pH、接种量、发酵温度和发酵时间，利用RSM 建立响应面模型。从回归模型可知，接种量对EPS 含量的影响极显著（P＜0.01），初始pH、发酵温度影响显著（P＜0.05），发酵时间影响不显著，且各因素的影响顺序为：接种量＞发酵温度＞初始pH＞发酵时间。在此基础上，用ANN 对获得的数据进行建模，通过GA 求解该模型的最优值，得到最优发酵工艺条件为植物乳杆菌9sh、发酵乳杆菌SR2-6、柠檬明串珠菌GM11 的菌种比例2：1：1，乳糖6%，大豆肽0.6%，初始pH4.5，接种量8%，发酵温度30 ℃，发酵时间60 h。通过验证实验获得最大EPS 含量为3.537 g/L，与神经网络模型得到的预测值基本一致。综上所述，RSMANN 可用于蓝莓汁产EPS 工艺的建模优化，为开发功能性乳酸菌发酵果蔬汁产品奠定了理论基础。