基于逐步回归分析法的玉竹多糖吸湿因素探索及其防潮中间体片剂的研制

邓碧莲，吴 璐，李 婷，柳 婷，欧阳征海，杨华生

（江西中医药大学药学院，江西南昌 330004）

玉竹为百合科植物玉竹Polygonatum odoratum（Mill.）Druce 的干燥根茎，是常见的药食两用中药[1]，主要含有多糖、皂苷、黄酮等多种药理活性成分[2-4]。其中多糖是玉竹研究聚焦的重要成分，也是评价玉竹质量的主要指标[5]。研究表明，玉竹多糖具有确切的降血糖等作用，常用于糖尿病的治疗[6]。然而，玉竹多糖吸湿明显，吸湿后的多糖黏性增强，容易出现结块、团聚甚至液化等现象，不仅影响其稳定性，还能显著影响其储存及后续制剂的工艺操作。

多糖吸湿与很多因素有关，包括多糖的纯度以及蛋白质、单糖等杂质的含量等，同时与多糖的粉体学性质有关，如粒径、比表面积等[7]。针对不同的因素，可采用相应的方法降低多糖的吸湿性。如多糖吸湿与杂质有关，可去除其中含有的蛋白质、单糖等杂质，提高多糖纯度，降低吸湿性；如多糖吸湿与粉体学性质有关，则可通过改性等方法增加粒径、降低比表面积，进而降低其吸湿性。比表面积与粒径成反比，比表面积越大，粒径越小，吸湿越明显。而增加粒径、降低粉体比表面积的方法主要有两种：一种是制粒，即将粉末制成颗粒。有研究发现，五味子多糖制备成颗粒后，粒径增加，比表面积降低，吸湿性明显减小[8]。另一种是制片，即将粉末压制成片剂。与制粒比较，制片可使粉体的比表面积进一步缩小，吸湿性进一步降低，防潮效果更佳，且体积小，便于保存、运输。同时，制备的片剂可再作为颗粒剂、胶囊、片剂等中药制剂的原料。可以看出，为降低吸湿性而制备的多糖片剂，主要目的是防潮，且具有中药中间体的性质，故也称为防潮中间体片剂。

然而，目前有关玉竹多糖吸湿因素、防潮方法的研究很少；而逐步回归分析是一种从众多因素中找到显著因素的分析方法，广泛用于医学、气象学、经济学等领域；其通过建立最优回归方程，方程中只包含影响显著的因子，而其余影响不显著的因子均被剔除[9]。因此，本试验以玉竹多糖为研究对象，先采用逐步回归分析法，研究玉竹多糖含量，杂质蛋白质、果糖含量，以及中位径D50、分布跨度Span、比表面积、休止角、松密度、振实密度对吸湿性的影响，探索导致玉竹多糖吸湿的主要因素；在此基础上，将玉竹多糖制成防潮中间体片剂，降低玉竹多糖的比表面积；再运用单因素实验和Box-Behnken 响应面法，优化玉竹多糖防潮中间体片剂的处方，并对其吸湿性进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉竹饮片 安徽道源堂中药饮片有限公司；D-果糖 上海源叶生物科技有限公司；无水葡萄糖西陇科学股份有限公司；牛血清白蛋白 北京索莱宝科技有限公司；考马斯亮蓝G250 北京索莱宝科技有限公司；磷酸 西陇化工股份有限公司；PH-102 微晶纤维素 湖州新望药用辅料有限公司；无水乳糖镇江市康富生物工程有限公司；硬脂酸镁 广州康本生物科技有限公司。

Agilent 1260 高效液相色谱仪 美国Agilent 公司；ELSD 6000 蒸发光散射检测器 美国Alltech 公司；Mastersizer 2000 激光粒度测定仪 英国Malvern 公司；BT-1000 型粉末综合特性测定仪 丹东百特仪器有限公司；752 紫外可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司；DP30A 单冲压片机 北京国药龙立科技有限公司；YD-1A 片剂硬度测试仪 天津市光学仪器厂；CS-1 脆碎度测试仪 天津市国铭医药设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 基于逐步回归分析法探索玉竹多糖吸湿的主要因素

1.2.1.1 玉竹多糖的制备 取玉竹，加水回流提取2 次，每次2 h，合并滤液，浓缩至生药浓度为1 g/mL的玉竹浓缩液。将浓缩液分为五份，加入无水乙醇至含醇量分别为70%、75%、80%、85%、90%，放入4 ℃冰箱静置过夜，过滤，取沉淀真空干燥，即得不同醇沉浓度的玉竹多糖。取70%醇沉浓度所得的玉竹多糖，分为四份，研钵中研磨，过筛，得到粒径为50～65 目、65～80 目、80～100 目、100～120 目的样品。同法制备75%、80%、85%、90%醇沉浓度得到的多糖不同粒径的样品，编号见表1[10]。

1.2.1.2 玉竹多糖的多糖、蛋白质、果糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量，配制玉竹多糖及系列葡萄糖标准品溶液，加入苯酚、浓硫酸，反应后在490 nm 处测定其吸光度，依据葡萄糖标准曲线计算多糖含量[11]；

采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，配制玉竹多糖及牛血清白蛋白标准品溶液，加入考马斯亮蓝G250 酸性染色液，立即混匀，在595 nm 的波长处测定吸光度，以牛血清白蛋白线性方程计算蛋白质浓度[12]。

制备玉竹多糖及系列果糖标准品溶液，采用HPLCELSD 法测定果糖含量，色谱柱为Kromasil 100-5-NH2（250×4.6mm，5 μm）柱，流动相为乙腈-水（75：25），流速1.0 mL/min，柱温为30 ℃，漂移管温度为105 ℃，空气体积流量为3.2 L/min。以进样量的对数为横坐标，以峰面积的对数为纵坐标，依据果糖标准曲线计算待测液中果糖浓度，计算果糖含量[13]。

1.2.1.3 玉竹多糖粉体学参数的测定 采用激光粒度仪测定粉体的中位径D50、分布跨度Span、比表面积[14]；采用粉体综合特性仪测定粉体的休止角[15]、松密度和振实密度[16]。

1.2.1.4 玉竹多糖吸湿率测定 取干燥具塞称量瓶，于放有过饱和氯化铵溶液的干燥器中放置24 h，精密称定质量m1。取玉竹多糖粉末适量，平铺于称量瓶中，厚度约为1 mm，精密称定质量m2。将称量瓶敞口，并与瓶盖同置于干燥器中，25 ℃保存，120 h取出，精密称定重量，记录质量m3，每种样品粉末平行测定3 次，吸湿率计算公式：吸湿率（%）=（m3-m2）/（m2-m1）×100[17]。

1.2.1.5 逐步回归分析 逐步回归是一种双向筛选的方法，在每引入一个变量，都要对回归方程中每一个自变量进行显著性检验，当一个或几个自变量的作用无显著性意义时，则会剔除，尽可能将回归效果显著的自变量选入回归方程[18]。以多糖含量（X1）、蛋白质含量（X2）、果糖含量（X3）、中位径D50（X4）、分布跨度Span（X5）、比表面积（X6）、休止角（X7）、松密度（X8）、振实密度（X9）为自变量，玉竹多糖120 h吸湿率为因变量（Y），应用SPSS 21.0 软件进行逐步回归分析。

1.2.2 防潮中间体片剂的制备

1.2.2.1 制备工艺 采用粉末直接压片法，将玉竹多糖、稀释剂分别粉碎，过80 目筛，混合，再加入润滑剂，混合均匀，置于压片机中压制成片剂[19]。

1.2.2.2 单因素实验 取玉竹多糖粉末，固定稀释剂微晶纤维素MCC 的用量（15%）及润滑剂硬脂酸镁的用量（0.6%），片剂的直径设置为8、9、11、20 mm，考察直径对吸湿率、硬度、脆碎度的影响。固定片剂其它因素，考察稀释剂MCC、乳糖、预胶化淀粉、甘露醇、糊精等5 种常用的稀释剂对粉体休止角及片剂吸湿率、硬度、脆碎度的影响[20]，稀释剂用量均为玉竹多糖的15%；在此基础上，分别考察乳糖、MCC 用量（5%、10%、15%、20%、25%、30%）对休止角、吸湿率、硬度、脆碎度的影响；最后考察润滑剂种类（PEG 4000、微粉硅胶、硬脂酸镁）、用量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）对休止角、吸湿率、硬度、脆碎度的影响。

1.2.2.3 评价指标的测定 将玉竹多糖制成片剂，吸湿率是重点关注的指标，而为了使压片过程顺利进行，表征粉体的流动性的休止角也是需要考虑的；同时，为使玉竹多糖防潮中间体片剂能较长时间储存，其硬度、脆碎度也是应该关注的。因此，选择吸湿率、休止角、硬度、脆碎度为片剂评价指标。将玉竹多糖、稀释剂、润滑剂混合后，按1.2.1.3 项下方法测定混合粉末的休止角；取制备的片剂于称量瓶，余同1.2.1.4项下方法测定片剂24 h 吸湿率；分别采用脆碎度测试仪、硬度测试仪测定片剂的脆碎度、硬度[21]。

1.2.2.4 响应面试验 在单因素实验结果的基础上，以片剂吸湿率（Y1）、粉体休止角（Y2）、片剂硬度（Y3）、片剂脆碎度（Y4）为因变量，乳糖用量（A）、MCC 用量（B）、硬脂酸镁用量（C）为自变量，利用Design Expert 8.0.6 优化玉竹多糖防潮中间体片剂处方。因素、水平安排见表2。

表2 Box-Behnken 设计的考察因素和水平Table 2 Investigation factors and levels of Box-Behnken design

1.2.3 防潮中间体片剂吸湿性对比分析 在优化了玉竹多糖防潮中间体片剂处方的基础上，进一步对其吸湿性进行了对比分析。取玉竹多糖粉末，按上述最佳处方的辅料量混合，得防潮中间体粉末；将玉竹多糖粉末、防潮中间体粉末压片，分别得多糖片剂、防潮中间体片剂。测定多糖粉末、防潮中间体粉末、多糖片剂、防潮中间体片剂2、4、8、12、24、48、72、96、120 h 的吸湿率。

再对防潮中间体片剂的临界相对湿度进行对比分析。取多糖粉末、防潮中间体粉末、多糖片剂、防潮中间体片剂，精密称定质量，置于干燥已精密称定质量的称量瓶中，置于放有变色硅胶的干燥器中12 h，平衡，备用。将上述平衡好的称量瓶精密称定，置于相对湿度分别为23%、43%、55%、69%、80%、84%、92%的干燥器中，于25 ℃下保存72 h，取出称量瓶，精密称定，计算吸湿率。以吸湿率为纵坐标，相对湿度为横坐标作图，对作图中曲线两端做切线，两切线的交点对应的横坐标即为临界相对湿度[22]。

最后采用SPSS 21.0 软件，以零级过程（Y=A+BX）、一级过程（Y=Y∞（1-e-kX）、一元二次曲线（ Y=A+BX+CX2） 、 双指数模型（ Y=Y∞-Ae-k1X+Be-k2x）、Logarithmic 模型（Y=A+BlnX）、Higuchi 模型（Y=AX1/2）、Sweibull1 模型（Y=A-Ae-（BX（1-C））D）、Sweibull2（Y=A-（A-B）e-（CX）D）模型等八种模型对吸湿过程进行拟合（模型中Y 为吸湿率，X 为时间，Y∞为平衡吸湿常数，k1为吸湿速率常数，k2为扩散速率常数，其余为模型参数），通过决定系数（R2）、残差平方和（RSS）和赤池信息准则（AIC）3 个统计参数来检验模型的拟合效果，R2的数值越接近1，表明曲线的拟合效果越好，RSS 和AIC 的数值越小，表明曲线的拟合效果越好[23]。

1.3 数据处理

数据采用SPSS 21.0 软件进行逐步回归分析和吸湿模型拟合，采用Design-Expert8.0.6中Box-Behnken 进行模型建立和方差分析，采用Origin 2019b 进行结果的绘图制作，所有试验均做三次平行，试验结果以（平均值±标准差）表示。

2 结果与分析

2.1 玉竹多糖的多糖、蛋白质、果糖含量及粉体学参数

玉竹多糖、蛋白质、果糖含量及粉体学参数测定结果见表3，随着醇沉浓度的升高，玉竹多糖粉末中的多糖、蛋白质、果糖的含量也升高，当醇沉浓度达到90%时，含量达到最高。多糖、蛋白质、果糖均为水溶性物质，醇的浓度越高，多糖的溶解度越低，因此可采用高浓度醇来提高多糖的得率[24]，然而这也提高了蛋白质、果糖等水溶性杂质的含量。因此，采用水提醇沉法制备多糖，常采用Sevage试剂去除蛋白质，采用半透膜去除小分子糖，以制备纯化多糖[25-26]；同时，从表3 还可以看出，粒径与D50、松密度、振实密度、比表面积、休止角增大也存在密切联系，玉竹多糖粉体粒径减小，D50、松密度和振实密度也减小，而比表面积、休止角增大，这与文献报道的一致[27-28]。

表3 多糖含量、蛋白质含量、果糖含量、粉体学性质和吸湿率测定结果（ x¯±s，n=3）Table 3 Determination results of polysaccharide content, protein content, fructose content, powder properties and moisture absorption rate ( x¯±s, n=3)

2.2 玉竹多糖吸湿率

不同纯度、不同粒径的玉竹多糖样品的吸湿率结果见表3，比表面积越大，吸湿率越大，松密度越大，吸湿率越小。比表面积是表征粉体粒子大小的一种量度，也是表示粉体吸附能力的重要指标。多糖分子中含有大量的羟基等极性基团[29]，易吸附水分子；玉竹多糖比表面积增大，故其与水分子的接触面积也增大，吸湿增加，这与文献报道的一致[30]。松密度是粉体质量除以该粉体所占的体积而计算的密度。一般地，松密度越小，比表面积越大，比表面积与吸湿密切相关，因此松密度与吸湿也存在一定关联。

2.3 逐步回归分析

以120 h 吸湿率为因变量（Y），以多糖含量等9 个指标为自变量，逐步回归分析得到的方程为：Y=16.342+0.355X2+0.337X3+0.379X6-0.156X8

（R2=0.976），式中正、负号表示因变量随自变量的变化方向，系数的绝对值表示影响的大小。由回归方程可知，导致玉竹多糖粉体吸湿的主要因素有比表面积、蛋白质含量、果糖含量、松密度（P＜0.05），而D50、Span、振实密度、休止角对玉竹多糖吸湿率无显著影响（P＞0.05）。从因子的系数可以看出，比表面积对玉竹多糖吸湿率影响最大，这结果也与2.2 项下的直观分析一致。同时，玉竹多糖中含有的蛋白质、果糖等杂质，也是导致玉竹多糖吸湿的次要因素。一方面，蛋白质、果糖含有大量的羟基、氨基等极性基团，易与水分子结合，从而导致多糖的吸湿性增强；另一方面，多糖、蛋白质、果糖均为水溶性物质，基于Elder 假说，水溶性药物的混合物比单一水溶性药物更加容易吸湿[31]。

2.4 防潮中间体的制备

2.4.1 单因素实验 片剂直径对吸湿率、硬度和脆碎度的影响，结果见图1A1～图1A2。图1A1 显示，片剂直径增加，吸湿率显著下降（P＜0.05），而直径对片剂的硬度、脆碎度无显著影响（P＞0.05）（图1A2），故确定玉竹多糖防潮中间体片剂的直径为20 mm。稀释剂种类对休止角、吸湿率、硬度、脆碎度的影响，结果见图1B1～图1B2。结果显示，与MCC 相比，甘露醇与多糖混合后粉体的吸湿率显著减小（P＜0.05），但流动性差，而乳糖、MCC 分别与多糖混合后，流动性好，且吸湿率也较小。因此，玉竹多糖防潮中间体片剂选择乳糖、MCC 为稀释剂。进一步考察乳糖的用量对休止角、吸湿率、硬度、脆碎度的影响，结果见图1C1～图1C2。结果显示，乳糖用量越大，吸湿率、休止角、脆碎度越小，硬度越大。当用量达到20%时，继续增加用量，吸湿率、休止角、脆碎度变化较小，因此选择5%～20%进行后续试验。MCC 用量对休止角、吸湿率、硬度、脆碎度的影响，结果见图1D1～图1D2。结果显示，MCC 用量越大，其吸湿率、休止角、脆碎越小，硬度则越大。当用量达到20%时，继续增加用量，吸湿率、休止角、脆碎度变化不明显，因此选择MCC 用量为5%～20%进行后续实验。润滑剂种类对休止角、吸湿率、硬度、脆碎度的影响，结果见图1E1～图1E2。结果显示，硬脂酸镁与多糖混合后粉体的休止角最小，而三种润滑剂对吸湿率、硬度和脆碎度无明显差异，因此，选择硬脂酸镁为润滑剂。硬脂酸镁用量对休止角、吸湿率、硬度、脆碎度的影响，结果见图1F1～图1F2。结果显示，休止角随硬脂酸镁用量的增加而逐渐减小。当用量达到1%时，继续增加用量，休止角变化不显著（P＞0.05）。因此选择用量为0.2%～1.0%进行后续试验。

图1 片剂直径、稀释剂、润滑剂对休止角、吸湿率、硬度、脆碎度的影响Fig.1 Effect of tablet diameter, diluent and lubricant on angle of repose, moisture absorption rate, hardness and friability

2.4.2 响应面试验 在单因素实验结果基础上，选取择乳糖用量（A）、微晶纤维素用量（B）、硬脂酸镁用量（C）为考察因素，即自变量，以吸湿率（Y1）、休止角（Y2）、硬度（Y3）、脆碎度（Y4）为评价指标，即因变量，采用Box-Behnken 设计-响应面法进行处方优化，结果见表4；再采用Design-Expert 8.0.6 软件进行二次多项式拟合，以相关系数R、P为判定标准，所得回归方程如下：

表4 Box-Behnken 设计的试验安排及结果Table 4 Test arrangements and results of Box-Behnken design

方差分析结果表明，模型拟合的效果均显著（P＜0.05），失拟项则均不显著。吸湿率（Y1）方差分析见表5，因素A、B，二次项A2、B2、C2均极显著（P＜0.01），交互项AB 为显著（P＜0.05）；休止角（Y2）方差分析见表4，因素C 为极显著（P＜0.01），二次项A2、C2均影响显著（P＜0.05）；硬度（Y3）方差分析见表6，因素A、B，二次项A2均显著（P＜0.05）；脆碎度（Y4）方差分析见表5，因素A、B 均极显著（P＜0.01），其他单因素、交互项和二次项则均不显著（P＞0.05）。根据回归模型的数学分析，得片剂的最优处方为：乳糖用量17.30%、微晶纤维素用量16.74%、硬脂酸镁用量0.80%。

表5 吸湿率（Y1）和休止角（Y2）回归模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model for moisture absorption rate (Y1) and angle of repose (Y2)

表6 硬度（Y3）和脆碎度（Y4）回归模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model for hardness (Y3) and fragility (Y4)

2.4.3 处方工艺验证 基于实际情况，将最优处方微调整为：乳糖用量17.00%、微晶纤维素用量17.00%、硬脂酸镁用量0.80%；按此处方制备3 批玉竹多糖防潮中间体片剂，测定吸湿率（Y1）、休止角（Y2）、硬度（Y3）、脆碎度（Y4），并与预测值比较，结果见表7。结果表明，实测值与预测值基本吻合。

表7 最优处方验证Table 7 Validation of optimal formulation

2.5 防潮中间体片剂吸湿性对比分析

多糖粉末、防潮中间体粉末、多糖片剂、防潮中间体片剂见图2。可以看出，多糖粉末（图2A）有吸湿团聚现象，将其压制成片剂（图2B）后，吸湿有所下降，但压制时粉体的流动性差；而将多糖粉末加入辅料制成防潮中间体粉末（图2C），吸湿团聚现象改善，流动性增加，进一步将防潮中间体粉末制成防潮中间体片剂（图2D），吸湿性明显降低，且压片时不易黏冲，片剂表面光洁。测定多糖粉末、防潮中间体粉末、多糖片剂、防潮中间体片剂吸湿率，结果见图2E。结果显示，平衡吸湿率从大到小为多糖粉末＞防潮中间体粉末＞多糖片剂＞防潮中间体片剂，分别为22.25%、16.60%、14.03%、11.03%。结果表明，辅料有一定的防潮作用，而压成片剂后，吸湿率进一步显著降低。

图2 防潮中间体片剂的平衡吸湿率及临界相对湿度Fig.2 Equilibrium moisture absorption rate and critical relative humidity of moisture-resistant intermediate tablet

多糖粉末、防潮中间体粉末、多糖片剂、防潮中间体片剂的临界相对湿度分别为48.40%、59.58%、66.40%、75.00%，结果见图2F。结果表明，多糖粉末制成防潮中间体片剂后，其临界相对湿度显著增加。同时也提示，玉竹防潮中间体片剂的储存环境，其相对湿度应控制在75%以下。将多糖粉末、防潮中间体粉末、多糖片剂、防潮中间体片剂吸湿过程进行模型拟合，结果见表8。结果表明，在8 种吸湿模型中，多糖粉末、防潮中间体粉末、多糖片剂、防潮中间体片剂以双指数模型的拟合效果最好；双指数模型拟合结果见表9。

表8 吸湿模型拟合结果Table 8 Fitting results of hygroscopic model

表9 多糖粉末、多糖片剂、防潮中间体粉末、防潮中间体片剂的双指数模型Table 9 Double exponential model of polysaccharide powder,polysaccharide tablet, moisture-resistant intermediate powder and moisture- resistant intermediate tablet

3 结论

本研究以玉竹多糖为研究对象，通过逐步回归分析法找到导致玉竹多糖吸湿的主要因素——比表面积，故采用制片的方法降低比表面积。在此基础上，采用单因素实验、Box-Behnken 设计-响应面法优化处方，得到玉竹多糖防潮中间体片剂的最优处方为乳糖用量17.00%、MCC 用量17.00%、硬脂酸镁用量0.80%。在此条件下制备玉竹防潮中间体片剂，与玉竹多糖粉末比较，平衡吸湿率由22.25%降低至11.03%，临界相对湿度由48.40%提高到75.00%。本研究结果不仅为玉竹多糖吸湿、储存提供了新视角，同时也为中药多糖、中药提取物的吸湿及储存提供新方法。需要指出的是，比表面积是导致玉竹多糖吸湿的主要因素，但对于其他中药多糖，比表面积对其吸湿性的影响需进一步研究。因此，接下来可以多种中药多糖为研究对象，探索比表面积对其吸湿的影响，阐明中药多糖吸湿的规律。