响应面法优化天然低共熔溶剂提取米糠蛋白工艺

刘伟麒，邓媛元，魏振承，张 雁，唐小俊，刘 光，周鹏飞, ，张名位,

（1.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，农业农村部功能食品重点实验室，广东省农产品加工重点实验室，广东广州 510610；2.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）

米糠（Rice bran，RB）是稻米精炼加工生成的副产物，是一种丰富的可再生资源。我国米糠资源总量一直位列世界之首，年产量至少可达1400 万吨。米糠富含碳水化合物、膳食纤维、维生素、蛋白质、γ-谷维素等生物活性成分，占稻米总营养的64%，且均为人体必须营养素[1-2]。

米糠蛋白（Rice bran protein，RBP）在米糠营养物质中占10%～15%[3]，其必需氨基酸组成完美契合世界卫生组织建议的最佳模式，且具备丰富的赖氨酸[4]。目前，深度开发RBP 产品是米糠高值化利用研究的热点之一。然而，RBP 在米糠中存在状态非常复杂，RBP 中的二硫键使蛋白质发生高度聚合，导致RBP提取率低[5]。目前提取RBP 的方法主要有碱法制备RBP[6-8]、酶法制备RBP[9]以及物理法制备RBP[10-12]。碱法制备RBP，较高的pH 会导致蛋白质结构被破坏、产生不良风味、色泽发生较大变化等不良作用[13]；物理法能够有效减少对米糠蛋白结构的破坏，但物理方式提取率较低[14]；酶法制备RBP 则是通过蛋白酶裂解米糠细胞壁，使部分蛋白质暴露，降低了碱溶时间，减少有毒物质的生成和蛋白褐变，但酶制剂因价格昂贵限制运用于实际生产[15]。因此，寻找一种高效便捷、绿色环保的提取方法制备RBP 对促进其工业化进程具有重要意义。

天然低共熔溶剂（Natural deep eutectic solvents，NADES）是一种新型溶剂[16]，其组成成分是由生物体内代谢产物如有机酸类、氨基酸类、醇类、胆碱衍生物、糖类等充当氢键供体 （HBD）或氢键受体（HBA），按照一定比例混合制备且在室温下呈均匀稳定的液体[17]。与传统试剂相比，NADES 具有廉价易得，无毒无害，可生物降解等优势[18]，在天然物质的分离及提取[19-20]、油脂精炼[21-22]等方面具有广泛的应用价值。研究表明NADES 在植物蛋白质、动物蛋白质、酶及氨基酸的提取等方面有显著效果，如Lin 等[23]采用氯化胆碱-尿素NADES 体系提取沙棘籽粕中的蛋白质相较于传统碱提法其氨基酸含量更高，且具有更好的体外消化率；Ester 等[24]通过高压放电并结合NADES 提取石榴籽中的蛋白质和多酚，发现NADES可以提高蛋白质和多酚的提取效率；Pang 等[25]通过采用由氯化胆碱-聚乙二醇来组成的NADES 并结合钠盐建立水性双相系统用于提取牛血清白蛋白以及木瓜蛋白酶，发现两者蛋白提取率分别为95.16%和90.95%；同时有研究发现采用不同组分的NADES提取蛋白并不会改变蛋白质的结构，再次证实了NADES 水性两相体系提取蛋白的有效性[26]。基于有关天然低共熔溶剂在提取植物蛋白质中具有较好优势的启发，选择环境友好、安全的绿色新型溶剂用于米糠蛋白的提取可实现米糠资源的高值化利用，而且NADES 具有一定的酸碱性，能有效破坏米糠组织结构，提升米糠蛋白提取效率，同时提取过程温和，不生成其他组分[27]。

本文通过设计不同组分NADES 及采用不同提取工艺对米糠蛋白提取，筛选出提取率优势明显的NADES 溶剂并建立其提取工艺，最后以料液比、反应温度、含水量以及提取时间开展单因素实验及响应面优化，确定最优工艺参数，进一步获得高提取率的米糠蛋白，并对NADES 提取米糠蛋白进行表征，为天然低共熔溶剂在开发米糠资源利用方面提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米糠 广东海纳农业有限公司；氯化胆碱、L-脯氨酸、甜菜碱、无水苹果酸、DL-乳酸、乙醇酸、乙二醇、甘油、木糖醇、尿素、乙酰胺 均购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

MILLI-Q 超纯水处理系统 Millipore 公司；SQP 电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；N-1300V-WB 旋转蒸发仪 上海爱郎仪器有限公司；CytationTM5 酶标仪 美国Bio Tek 公司；SH10A水分计 上海菁海仪器仪表有限公司；FiveEasy Plus™ FE28 pH 计 梅特勒-托利多仪器有限公司；AquaLab 4 TEV 水分活度仪 山东立博迪科学仪器股份有限公司；AR 1500EX 流变仪 美国TA 仪器；SB-800 DTD 超声清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器巩义市予华仪器有限责任公司；Allegra 64R 台式高速大容量离心机 贝克曼库尔特有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 天然低共熔溶剂的制备 通过称取一定质量的氢键受体和氢键供体，按特定摩尔比例混合，并在旋转蒸发仪上以80 ℃的条件旋蒸至形成稳定透明液体。10 种溶剂具体组成如下表1 所示。

表1 天然低共熔溶剂的制备Table 1 Preparation of NADES

1.2.2 米糠蛋白的提取 对照组模式体系为精确称取4 g 米糠，与30 g 蒸馏水混合均匀，用1 mol/L NaOH 调至pH 至10.0。实验组模式体系为精确称取4 g 米糠，加入30 g NADES 于50 ℃水浴恒温提取2 h，10000 r/min 离心5 min，收集上清液作为待测液，以上提取过程作为模式体系。同时本研究采用超声和水浴搅拌两种处理方式考察对米糠蛋白提取的影响，6 种处理方法具体过程如下：方法1-水浴提取2 h；方法2-超声提取2 h（50 ℃、180 W）；方法3-先水浴提取30 min，再超声提取30 min，循环操作2 次；方法4-先超声提取30 min，再水浴提取30 min，循环操作2 次；方法5-先水浴提取60 min，再超声提取60 min；方法6-先超声提取60 min，再水浴提取60 min。每组实验平行操作3 次。

1.2.3 提取米糠蛋白单因素实验与响应面优化

1.2.3.1 提取米糠蛋白单因素实验 根据上述条件设计综合考量，选取最适的NADES 对米糠蛋白进行提取。同时对样品处理的条件为提取温度50 ℃、提取时间2 h、含水量为4%，以此考察米糠/NADES 料液比（4:30、5:30、6:30、7:30、8:30、9:30 g/g）对RBP 提取率的影响；对样品处理的条件为提取温度50 ℃、提取时间2 h、料液比为9:30，以此考察NADES体系含水量（1%、2%、3%、4%、5%）对RBP 提取率的影响；对样品处理的条件为提取温度50 ℃、含水量4%、料液比为9:30 g/g，以此考察提取时间（1、2、3、4、5 h）对RBP 提取率的影响；对样品处理的条件为提取时间2 h、含水量4%、料液比为9:30 g/g，以此考察提取温度（40、50、60、70、80 h）对RBP 提取率的影响。其中，探究每组实验平行操作3 次。

1.2.3.2 响应面试验优化提取米糠蛋白提取条件由单因素实验1.2.3.1 的结果，选取提取时间（A）、提取温度（B）和PG 含水量（C）为3 个显著性因素，各因素综合考虑米糠蛋白提取率最高因素，且实验室前期发现，以各单因素最高点并延后两个梯度点，在该条件下同时可以提取米糠酯酶，酯酶活性较高[28]，故选取提取时间为4%、含水量为4%以及提取温度为70 ℃通过Box-Behnken Design（BBD）实验进一步确定最优提取工艺，具体设计如表2，每组实验平行操作3 次。

表2 BBD 的因素及水平Table 2 Variables and levels of Box-Behnken Design

1.2.4 米糠蛋白质提取率的测定 RBP 浓度的测定采用Bradford[29]法。

标准曲线的绘制：采用考马斯亮蓝G-250 染料试剂盒中方法进行梯度稀释，检测时分别在96 孔板加入5 μL BSA 和200 μL 考马斯亮蓝G-250 溶液，混匀，2 min 后在595 nm 下测定吸光值。每组三次平行实验。以蛋白浓度和对应的吸光值绘制标准曲线[29]，结果公式为y=0.0431x+0.039，决定系数为R2=0.999：蛋白浓度的测定：NADES 富集相中的RBP，按照上述方法测定蛋白质的浓度。不同条件下改变样品稀释倍数确保测定结果的准确性。每一样品组均设立相应的空白组，同时设立对照组，减少NADES对吸光度测定的干扰。

蛋白提取率的计算：参照GB 5009.5-2016 中凯氏定氮法测定米糠中蛋白质的含量。NADES 提取RBP 的提取率按照公式（1）算：

1.2.5 天然低共熔溶剂提取米糠蛋白的表征

1.2.5.1 红外（Fourier transform infrared，FT-IR）测定

水处理组精确确称取4 g 米糠，与30 g 蒸馏水混合均匀，用1 mol/L NaOH 调至pH 至10.0，经反应后将样品以8000 r/min 转速离心10 min 后取上清液；PG 处理组采用4 g 米糠与30 g PG 试剂在由响应面实验确定的最佳工艺条件进行反应后以8000 r/min转速离心10 min 后取上清液；PG 试剂组为1.2.1 方法制备的PG 溶剂。

将三组样品进行傅里叶红外光谱检测，观察在提取蛋白质过程中蛋白质与NADES 之间是否存在相互作用。参考Zhou 等[30]的方法，探究NADES 的傅里叶红外光谱扫描500～4000 cm-1范围内的吸收图谱。

1.2.5.2 扫描电镜（Scanning electronic microscopy，SEM）检测 对未处理米糠、对照组提取后残渣及NADES溶剂处理后残渣进行了表面形貌分析。样品处理如下：未处理的米糠和对照组提取后残渣用正己烷脱脂，风干水分得待测样品。NADES 溶剂提取后的残渣取适量，用超纯水清洗残留溶剂，至清洗液pH 至7.0，再风干水分，即得提取后残渣待测样。将风干后的样品用导电胶固定在载物台上，镀金后采用JSMIT100 InTouchScopeTM 扫描电子显微镜研究样品的结构。

1.3 数据处理

实验均进行三次平行实验，响应面实验设计和数据处理采用Design expert 软件，实验结果以平均值±标准差表示。所有数据通过SPSS 26 进行单因素方差的Duncan 事后检验，图中小写字母标识相同溶剂不同方法之间的显著性差异（P＜0.05），大写字母标识同种方法不同溶剂之间显著性差异（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 提取方法和天然低共熔溶剂的筛选

本实验比较了NADES 体系中超声和水浴搅拌及两种方式结合的方法对RBP 提取率的影响，由图1可知，部分NADES 采用水浴法提取其RBP 提取率均高于其他方法，其中CGa、CU、CG、PG 体系通过水浴搅拌法RBP 提取率分别达到48.62%、35.06%、48.24%以及73.55%，并且PG 体系在除了超声方法处理组外其余方法组表现较好的提取效果，故选取PG 体系，水浴搅拌法对后续样品组进行处理。

图1 有机酸类（a）、胺类（b）、多元醇类（c）、氨基酸类（d）NADES 提取的RBP 提取率Fig.1 Extraction efficiency of RBP in organic acid (a), amine(b), polyols (c), amino acid (d)-based NADES

2.2 单因素实验

2.2.1 料液比对米糠蛋白提取的影响 由图2 可知随着米糠添加量不断增加，RBP 的提取率在料液比为8:30 g/g 时显著升高（P＜0.05），继续增加米糠量，RBP 提取率整体无明显变化，当料液比为9:30 g/g时，RBP 提取率最高，提取率为73.55%。随着料液比增加，能最大程度实现溶剂与米糠物料发生反应，致使RBP 提取率增高，此后随着物料增加PG-RB体系搅拌愈发困难，这导致米糠物料与溶剂之间接触不充分，影响处理过程物料间传质，故最终选择料液比为9:30 g/g 进行下一步实验。

图2 料液比（米糠/NADES）对RBP 提取率的影响Fig.2 Effect of material-liquid ratios (rice bran/NADES) on the extraction efficiency of RBP

2.2.2 天然低共熔溶剂的含水量对米糠蛋白提取的影响 由于NADES 粘度较高，在操作过程中存在局限性，因此有必要降低PG（526.4 mPa·s）的粘度。添加少量水分能有效降低NADES 的粘度[31]。作者团队探究了不同含水量对NADES 粘度的影响，结果如图3 所示。当在50 ℃时，PG 溶剂粘度为526.4 mPa·s，含水量为5%时，其粘度降低到202.4 mPa·s。研究发现，NADES 体系少量的水有利于维持其稳定结构，体系过多水分则会破坏溶剂本身氢键网络结构，其分子间相互作用减少，从而使NADES 粘度降低[32]。本文希望通过添加少量的水使得NADES 粘度降低，与米糠物料充分发生反应，达到提高RBP 提取率的目的，因此探究了不同含水量（0、1%、2%、3%、4%、5%）对RBP 提取率的影响。结果如图4，在极低的含水量（0～3%）的PG 中，蛋白质提取率显著增加（P＜0.05） ，这是因为水分含量的增加降低了PG 的粘度，使得蛋白质的扩散速率大大增加[33]。含水量继续增加后（4%～5%），蛋白质提取速率开始降低，这是由于NADES 粘度降低，氢键网络结构遭到破坏，PG 与蛋白质之间的相互作用减弱。故选择3%～5%含水量的PG 溶剂进一步优化。

图3 温度对不同含水量PG 粘度的影响Fig.3 Effect of temperature on the viscosity of PG with different water contents

图4 含水量对RBP 提取率的影响Fig.4 Effect of water content on the extraction efficiency of RBP

2.2.3 提取时间对米糠蛋白提取的影响 在料液比9:30 g/g，PG 含水量为4%时，考察了处理时间对RBP提取率的影响，结果如图5 所示。提取时间在0.5～3 h 之间，RBP 提取率逐渐增加，说明在提取过程中，提取时间过短会导致提取不充分，影响RBP 的提取率，而随着提取时间延长，NADES 与米糠物料充分反应，RBP 提取率显著增加。当反应时间为3 h 时，到达NADES 与该米糠料液比例达到最大反应速度，故3 h 后RBP 提取率无明显变化，选择3～5 h 提取时间进一步优化。

图5 提取时间对RBP 提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on the extraction efficiency of RBP

2.2.4 反应温度对米糠蛋白提取的影响 在料液比9:30 g/g，PG 含水量为4%以及处理时间为3 h 时，研究了40～80 ℃温度范围下对RBP 提取率的影响。结果如图6 所示，发现随着温度升高，RBP 提取率增高，这可能是温度增加了物料之间的传质有利于米糠蛋白的释放。温度到达60 ℃后，RBP 提取率呈现降低的趋势，这可能是由于温度过高，提取的米糠蛋白发生变性，导致蛋白提取率降低。反应温度为60 ℃时，RBP 的提取率最高，故选择60～80 ℃进一步优化。

图6 不同反应温度对RBP 提取率的影响Fig.6 Effect of different reaction temperatures on the extraction efficiency of RBP

综合考虑，并参照四个因素显著性分析结果，确定料液比为9:30 g/g，选用含水量、温度以及时间3 个因素进行后续响应面优化分析。

2.3 响应面优化试验

本团队研究发现采用NADES 可以有效地提取米糠酯酶[28]，且效果较优，其单因素最优条件为料液比9:30，提取时间4 h，含水量4%，反应温度为70 ℃，该条件均与天然低共熔溶剂提取米糠蛋白单因素实验最优条件无显著性差异，故将上述反应条件作为中心平行的实验方案。确定提取时间（A）、含水量（B）、提取温度（C）3 个水平，设定3 因素3 水平、5 次中心平行的实验方案，实验设计及米糠蛋白的提取率见表3。通过Design-Expert 10 软件对响应值进行二次响应面回归分析，结果见表3。

表3 响应面试验设计与响应值Table 3 Response design and results of experiment

经拟合回归后，得到米糠蛋白提取率相对各因素实际值的二次响应面回归方程为：Y=78.39-2.22A+2.69B-3.48C-0.69AB-1.16AC-0.49BC-0.031A2-1.29B2-3.03C2。回归方程分析表可知，米糠蛋白提取率的回归模型P＜0.0001，表明回归方程具有很高的可靠性，结果有效。R2和校正系数R2调整后分别为0.9994 和0.9987。失拟项P=0.063773＞0.05 说明相对于纯误差不显著，该模型拟合程度高，实际值与预测值之间高度一致，实验结果误差对实验结果影响较小。根据回归方程分析结果（表4）发现，提取时间和提取温度及其P值均为＜0.0001，F值分别为617.2028和7437.858，而含水量P值则为0.0126，F值为11.09156，说明对米糠蛋白提取率影响最大的因素是提取温度，其次是提取时间，最后是含水量。

表4 响应值的回归方程分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) for hydrolysis activity

2.3.1 响应面分析 根据二次响应面回归方程构建三维响应面图和等高线图，描绘不同因素对RBP 提取率的影响及交互作用大小如（图7）所示，提取时间和PG 含水量之间的交互作用对米糠蛋白提取率影响最大，提取温度和PG 含水量之间的交互作用次之。

图7 提取温度、含水量及提取时间对RBP 提取率的交互影响Fig.7 Response surface of interaction of various factors for extraction yield of RBP

2.3.2 验证实验 由软件Design-Expert 10.0.1 结果显示最优条件为提取时间3.0847 h，反应温度为65.0807 ℃，含水量为4.77451%，该条件下RBP 提取率为82.8438%。结合实际操作方便，后续验证实验确定最佳提取工艺为：提取时间为3 h，反应温度为65 ℃，含水量为4.7%，在最佳实验条件下开展三次平行实验，得到PG 体系米糠蛋白提取率为82.69%±1.02%，实验结果与上述预测值接近，说明该模型准确性良好。

2.4 天然低共熔溶剂提取米糠蛋白表征

采用FT-IR 和SEM 考察了萃取前后米糠及其残渣结构的变化，以初步探究NADES 提取RBP 的行为。

2.4.1 FT-IR 测定 两种处理组及PG 的FT-IR 分析光谱见图8。PG 与PG 处理组相对于水处理组在3000～3700 cm-1处明显发现其振吸收范围变宽，这表明了PG 与PG 处理组形成了氢键作用，且作用力更强。将PG 和PG 处理组进行光谱分析，发现提取前后光谱图像相似，没有出现新的峰，这表明提取过程中没有产生新成分。

图8 对照组和PG 提取后蛋白质富集相的FT-IR 光谱Fig.8 FT-IR spectra of the protein-enriched phases after extraction of control group and PG

2.4.2 SEM 分析 通过采用SEM 分析了米糠经过不同方法处理后的表面形貌，结果如图9。结果显示，水提取后的米糠表面平滑，微观结构完好，米糠表面形态没有发生明显变化；PG 处理组的米糠微观结构明显被破坏，米糠内溶物（如RBP）释放，说明PG溶剂对RBP 的提取有显著作用，这与图1 得出的结论一致。

图9 米糠和米糠残渣的SEM（50 μm）Fig.9 SEM of rice bran and rice bran residue (50 μm)

由FT-IR 和SEM 数据可知，使用PG 溶剂处理米糠，米糠细胞遭到破坏，米糠中RBP 被大量释放，RBP 提取效率增加，同时在反应过程中，PG 溶剂并不会与RBP 发生反应，仅作为溶剂参与RBP 提取反应。

3 结论

本研究建立了一种NADES 辅助水浴搅拌法提取米糠蛋白的工艺。通过单因素和响应面优化实验，得到最优工艺条件为：反应体系为脯氨酸-甘油（摩尔比2:5），米糠与溶剂料液比为9:30 g/g，含水量为4.7%，水浴搅拌3.0 h，反应温度为65 ℃，米糠蛋白提取率为82.69%±1.02%。相较于传统水提法，采用NADES提取能有效破坏米糠细胞，释放蛋白，且在反应过程中不会产生新组分。结果表明，NADES 提取法具有简单、绿色环保且能高效提取米糠蛋白的优势。本研究结果对米糠深度加工及新型绿色溶剂在食品领域中的应用提供理论依据。