标本配穴针灸对腹泻型肠易激综合征大鼠血清心脏ANP BNP的影响*

邱宇驰 付伊萌

肠易激综合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是功能性胃肠道疾病,《2020年中国肠易激综合征专家共识意见》[1](简称共识)强调了精神心理因素是防治肠易激综合征的一个关键。重视精神心理是提高治疗IBS疗效的关键。中医的五脏学说认为“心主神”,心神失调,会出现焦虑和抑郁等精神障碍。同时心神失调与IBS内脏高敏感性密切联系。《素问·至真要大论》曰:“诸痛痒疮,皆属于心”。心主神明便具有感知和应对身体内外刺激的能力,心神对疼痛刺激因素的反应是形成疼痛的重要条件[2],故IBS的核心病理生理基础之一内脏高敏感性,在焦虑、抑郁等影响下会更加明显,这与心神失调引起机体对疼痛程度的感受异常密切相关。

目前,针对IBS伴随的焦虑、抑郁等情绪障碍西医治疗选用抗抑郁药物[3],有一定的不良作用。中医针灸作为绿色疗法,是西医治疗IBS的重要的替代疗法[4]。心房利钠肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)主要由心房合成分泌,在疾病状态下心房容量/压力增加,刺激ANP释放,具有调节应激反应和焦虑等情绪状态的作用[5]。研究报道,心理调适能够通过改善患者的焦虑抑郁情绪,减少儿茶酚胺的含量、减轻肾素-血管紧张素-醛固酮的作用,进而降低患者的B型利钠尿肽(B-type natriuretic peptide,BNP)水平[6]。因此,笔者选用“调心神,固肠腑”的标本配穴针灸,探究标本配穴针灸是否能够通过调控ANP、BNP表达,从而改善IBS-D模型大鼠的焦虑、抑郁情绪。

1 材料

1.1 动物与分组SPF级3月龄雄性SD大鼠40只,体质量(300±20)g,随机分为4组:对照组、模型组、标本配穴组、常规配穴组,每组10只。购于三峡大学实验动物中心,许可证号:SCXK(鄂)2017-0012。在武汉体育学院饲养,SPF级环境条件控制为温度(22±2)℃、湿度(50±10)%,光照明/暗周期为12 h/12 h[7],适应性喂养1周,期间自由饮食、饮水。动物实验伦理审核批准号:NO.00287500。严格遵照中华人民共和国科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[8]进行实验操作。

1.2 主要仪器与试剂BL-420S生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司);微量移液器(Eppendorf);垂直电泳槽(北京六一仪器厂,DYCZ-24DN);电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司,CPA);水平摇床(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司,TS-1);磁力搅拌器(江苏省金坛市中大仪器厂,T8-1);酶标仪(Thermo,mμlISKANMK3);离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司,HI650)。生理盐水(ASPEN,AS1087)戊巴比妥钠(Sigma,DS179);一次性针灸针(0.30 mm×13 mm,华佗牌);水银台式血压计(上海鱼跃医疗设备有限公司);Rat ANP ELISA Kit(ELK5450,ELK Biotechnology);Rat BNP ELISA Kit(ELK5457,ELK Biotechnology)。

1.3 模型制备除对照组大鼠外,其他3组以急、慢性应激相结合CAS方法制备IBS-D模型[9]。采取将大鼠暴露于7种不同的压力源,分别是缺水24 h、食物剥夺24 h、痛苦的夹尾巴1 min、暴露于45 ℃环境5 min、在4 ℃水中游泳3 min,白天和夜晚倒置12 h/12 h,水平振动(120 r/min)45 min。连续2 d保证无重复特定的压力源,若抓阄的压力源重复则重新抓取,共21 d。1周的休息之后,第28天,采取急性束缚应激方法,包裹大鼠的肩部、上肢前肢和胸廓1 h。当天测定内脏疼痛阈值[10],若模型组大鼠内脏疼痛阈值高于对照组(P<0.05),则提示造模成功[11]。

1.4 干预方法标本配穴组、常规配穴组大鼠在每日造模前,穿上自制合身的鼠衣,参照《实验动物常用穴位名称与定位第2部分:大鼠》[12]。标本配穴组选取“内关、足三里、关元”予以针灸干预,常规配穴组选取“上巨虚、天枢、足三里”予以针灸干预,均使用0.30 mm×13 mm华佗牌毫针直刺,针刺得气后进行手法行针,平补平泻,频率120次/min,每隔4 min行针1 min;悬挂并进行艾灸,自制艾条长12 cm,直径7 mm,用支架固定,置于穴位旁 2～3 cm,保证大鼠在平静的状态下,留针及艾灸时间为15 min,1次/d,共28 d。对照组和模型组不给予任何干预。

1.5 检测指标

1.5.1 内脏高敏感性测定测定内脏高敏感性,即观察腹壁撤退反射(Abdominal withdrawal reflex, AWR)。在造模前和第28天进行检测,检测前1 d大鼠禁食不禁水,操作时一人固定大鼠及暴露肛门,另一人一手手持蘸有液体石蜡的棉签,另一手顺着棉签的引入,将蘸有液体石蜡的自制气囊导管从肛门插入直至到标记位置(长度为4.5 cm处标记),再用医用胶带将导管固定于尾巴根部,然后将大鼠放置操作台上。待大鼠安静后,一人用自制血压计向气囊内缓慢平稳加压,另一人记录大鼠腹部抬离地面时或背部拱起所对应的压力值,每次测量间隔约5 min,每只重复测量3次取平均值[13]。

1.5.2 大鼠的行为学观察糖水偏好实验观察:每笼给予200 ml 1%蔗糖水溶液和纯化水各1瓶,12 h后对换1次2个瓶子位置,24 h后测量瓶内液体的消耗,糖水偏好率(%)=糖水摄入(ml)/(糖水摄入+纯水摄入)(ml)×100%[14]。旷场实验观察:第28天通过旷场实验进行行为学评估。实验员单独在观察室操作,环境要保证避光、安静,采用专业的旷场箱,底为100 cm×100 cm,其底面为黑色并平均分为16格,摄像头位于正中央,将大鼠放置旷场箱底部,观察5 min内大鼠的活动情况,并在每次结束后用酒精进行消毒、清洗旷场箱内部,以便影响下1只大鼠的自由活动,采用计算机软件进行录像记录。

1.5.3 血清 心脏组织内分泌肽检测2%戊巴比妥钠(0.2 ml/100 g)[15]腹腔注射麻醉,剖开胸腔,大鼠腹主动脉采血离心分离血清,-80 ℃低温冰箱储存备用,取出心脏组织,用生理盐水洗净,并放入-80 ℃冰箱保存备用。酶联免疫吸附法(ELISA)定量检测心房利钠肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)、B型利钠尿肽(B-type natriuretic peptide,BNP)含量,按试剂盒步骤说明操作。

2 结果

2.1 大鼠内脏疼痛阈值比较在造模前,4组大鼠进行内脏疼痛阈值测定比较,差异无统计学意义(P>0.05)。造模后,模型组大鼠内脏疼痛阈值低于对照组(P<0.01),提示造模成功。标本配穴组、常规配穴组大鼠内脏疼痛阈值高于模型组(P<0.01)。见图1。

注:与对照组比较,****P<0.01;与模型组比较,※※※※P<0.01。图1 大鼠内脏疼痛阈值比较

2.2 大鼠糖水偏好率比较模型组大鼠的糖水偏好率明显高于对照组(P<0.01),标本配穴组、常规配穴组大鼠的糖水偏好率低于模型组(P<0.01)。常规配穴组与标本配穴组大鼠比较糖水偏好率,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 大鼠糖水偏好率比较

2.3 大鼠旷场实验比较对照组大鼠的运动轨迹自由且总路程长,模型组大鼠的运动轨迹多在外围且总路程短;标本配穴组大鼠、常规配穴组大鼠较模型组运动轨迹范围更广且总路程增加。见图2。

注:图2A为对照组大鼠的5 min内的行动轨迹路径;图2B为模型组大鼠的5 min内的行动轨迹路径;图2C为标本配穴组大鼠的5 min内的行动轨迹路径;图2D为常规配穴组大鼠的5 min内的行动轨迹路径。图2 各组大鼠行动轨迹图

2.4 大鼠血清 心脏组织ANP BNP含量比较模型组大鼠血清中ANP、BNP含量高于对照组(P<0.01);标本配穴组大鼠血清中ANP、BNP含量低于模型组(P<0.01);常规配穴组大鼠与模型组大鼠比较血清中ANP、BNP含量,差异有显著统计学意义(P<0.01);但标本配穴组大鼠与常规配穴组大鼠比较血清中ANP、BNP含量,差异无统计学意义(P>0.05)。见图3A。模型组大鼠心脏组织中ANP、BNP含量高于对照组(P<0.05);常规配穴组大鼠心脏组织中ANP、BNP含量高于标本配穴组(P<0.05)。见图3B。

注:图3A、B为大鼠血清、心脏ANP、BNP含量变化。与对照组比较,****P<0.01,*P<0.05;与模型组比较,※※※※P<0.01;与标本配穴组比较,####P<0.01,#P<0.05。图3 大鼠血清 心脏ANP BNP含量变化

3 讨论

IBS属于中医学“肠郁”范畴,病因是心神失调,肠腑失司。在中医治病求本思想和标本理论的指导下,根据“病位在肠腑,脏腑为本,通调肠腑;病邪为标,祛除邪气,调养心神”理论,提出以标本配穴针灸防治IBS,以固护肠腑为主,调理心神为辅,标本兼治。标本配穴针灸对IBS的治疗,是重视心神不宁对肠腑功能的影响。认为该病是因心神不安,气机失调,导致肠腑失司。取内关,可充分发挥其宁心安神、调神定志之功效,改善焦虑、抑郁的状态,减轻心神失调对肠道的影响。陈慧君[16]探析焦虑症的针灸临床治疗及选穴特点,发现对焦虑症的治疗一般是“从脑论治”和“从心论治”。而百会、内关及神门穴治疗焦虑症具有特殊疗效,是关键穴位。内关穴在治疗焦虑症中多用补法加灸[16]。研究发现,氟哌噻吨美利曲辛联合针刺内关穴能显著缓解老年冠心病患者PCI术后焦虑抑郁状态[17]。对针灸治疗卒中后焦虑症的取穴规律进行数据挖掘,发现经脉的选择以督脉、手少阴心包经、手厥阴心经为多,而选穴多以百会、内关、神门、印堂[18]。

本研究选用CAS造模方法建立伴有精神障碍的IBS模型大鼠,并依据中医针灸治病求本思想,应用标本配穴法,选取“关元、足三里、内关”三穴进行腧穴配伍治疗,探究IBS与心相关的情绪心理的变化。模型组大鼠的内脏高敏感性高于对照组,为造模成功。标本配穴组和常规配穴组大鼠内脏高敏感性均低于模型组,说明标本配穴针灸和常规配穴针灸均能减轻大鼠的腹痛,减轻焦虑、抑郁的程度。抑郁样行为一般通过糖水偏好实验观察,糖水偏好率直接反映大脑的奖赏反应程度,而奖赏反应程度与快感缺失密切相关。焦虑样行为通常是通过旷场实验观察,反应其自由活动度。本实验中糖水偏好实验和旷场实验观察结果显示,IBS模型大鼠快感度缺失、自主活动度降低,情绪心理行为异常改变,处于焦虑、抑郁的状态。标本配穴组和常规配穴组糖水偏好率均高于模型组大鼠,说明标本配穴针灸和常规配穴针灸均能一定程度地改善大鼠快感度缺失程度,但标本配穴组的数值更趋向于对照组,效果更佳。旷场实验结果显示,标本配穴组和常规配穴组大鼠的行为学均有一定的改善,但标本配穴针灸更能改善焦虑状态,增加其活动自由度。

研究发现,ANP与焦虑障碍的发病密切相关,是联系心脏和焦虑行为的重要物质基础[19]。本实验模型组大鼠血清、心脏组织ANP含量均增加,一方面说明IBS-D大鼠处于焦虑状态,另一方面说明IBS-D大鼠在压力刺激下心脏相关物质产生了变化。也有研究提出,BNP与儿茶酚胺水平中度相关[20]。本实验模型组大鼠血清、心脏组织中BNP含量均升高,可能是模型大鼠处于焦虑状态,刺激了儿茶酚胺的释放,加强了肾素-血管紧张素-醛固酮的作用,升高了BNP水平。标本配穴组大鼠血清中ANP、BNP含量均低于模型组,常规配穴组大鼠血清中仅BNP含量下降;而在心脏组织中,标本配穴组大鼠ANP、BNP含量均下降,常规配穴组大鼠ANP、BNP含量均上升,说明标本配穴针灸更能够下调血清和心脏组织ANP含量,改善其焦虑情绪,并能减轻应激反应程度,减少血清和心脏组织BNP的分泌,而达到保护心脏的作用。

综上,标本配穴针灸能够通过降低血清、心脏ANP、BNP的表达,改善焦虑抑郁情绪,推测标本配穴针灸可能通过抑制ANP、BNP活性,从而调节IBS-D模型大鼠的焦虑、抑郁情绪。