自噬在乳腺癌中“双刃剑”作用的研究进展

吕学霞,王亚喜,王长松

(中国人民解放军联勤保障部队第九八九医院 病理科,河南 洛阳 471031)

自噬是一种保守的、无所不在的、非常重要的细胞降解蛋白质聚集物或破坏胞浆内容物、依赖溶酶体的保持细胞内稳定的分解代谢活动。自噬可被多种刺激因素所激发,如氧化应激、饥饿和糖缺乏等,自噬小体的产生及LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ是自噬的2个经典标志。自噬失控后可产生多种传染性和非传染性疾病,自噬相关性非传染性疾病包括肿瘤性和非肿瘤性疾病,如心血管疾病[1]、神经退变性疾病[2]以及皮肤病[3],自噬失控相关的恶性肿瘤包括结直肠癌[4]、胃癌[5]、乳腺癌[6]、肺癌[7]、白血病和淋巴瘤[8]、卵巢癌[9]以及其他癌症[10]。

自噬在肿瘤发生和治疗中的反应十分复杂,具有肿瘤环境依赖性,在癌症发展的不同阶段作用也有所不同。在癌症的初始阶段,自噬因其分解代谢的角色,降解和/或再利用某些细胞成分,如损坏的细胞器和错误折叠的蛋白等而起保护作用,抑制肿瘤的发生。自噬还可以通过癌症关联突变而阻滞瘤细胞的增殖,从而限制突变细胞的播散,甚至通过促进基因突变细胞的老化而抑制肿瘤的形成。然而,一旦肿瘤已经形成且开始进展,癌细胞会利用自噬机制为其提供营养并提供保护,如自噬能够增加瘤细胞抵抗氧化应激的能力,进而引起基因的不稳定和恶性转化。癌细胞利用自噬在代谢和治疗过程中的应激状态而长期存活。自噬能够为肿瘤细胞提供营养而促进瘤细胞的生长,同时也能清除无用的细胞内生物大分子对癌细胞产生的损伤而促进肿瘤的进展。自噬对于避免有害物质的沉积如蛋白质沉淀、有害的细胞有机物沉积以及对细胞有损害的致癌物质的聚集十分重要。不能有效地清除这些必需的、老旧的或毒性物质将会诱发细胞内炎症反应,最终产生活性氧(reactive oxygen species,ROS),导致细胞退变、凋亡或癌变。因此,自噬在恶性肿瘤的起始环节、进展、转移和侵袭过程中可能起着“双刃剑”的作用,尤其在乳腺癌(breast cancer,BC)中[11]。

BC年发病率和病死率居全球女性恶性肿瘤年的第一位,2019年就有4万例以上的BC患者死亡。尽管生活方式、遗传因素、环境因素及生物变异等均是BC发生的危险因素,但BC的发生机制还未完全明了。BC的治疗较为复杂,尽管综合运用多种治疗方法,如手术切除、化疗、放疗、靶向治疗等诸多手段,但目前的治疗方式还不够充足,治疗效果不够满意。更为困难的是BC患者常面临化疗抵抗、放疗抵抗、激素治疗抵抗以及靶向治疗抵抗等问题。因此,有必要探索BC发病的新机制,同时依托新的BC发生机制研发新型的抗BC物或新辅助治疗药物。

1 自噬与乳腺发育

正常乳腺组织的发育过程中,自噬在腺体结构发育和分化中起着十分关键的作用,同时还能保持细胞内环境的稳定。乳腺腺体细胞在发育过程中存在自噬现象,在此过程中,自噬相关基因(autophagerelated gene,ATG)发挥着重要作用,如ATG5和ATG7在乳腺非肿瘤性上皮细胞株MCF10A中的表达缺失导致凋亡前体caspase-3的增加及克隆形成能力的降低。当过表达的抗凋亡蛋白Bcl-2阻断凋亡后,失黏附细胞中自噬的缺失将导致细胞克隆活性降低。因此,失黏附介导的自噬可保护细胞免于发生凋亡。更有甚者在出生以后的乳腺腺体发育过程中,ATG7在乳腺上皮细胞发育阶段的缺失会阻断自噬进而影响能量代谢反应,这种失调归因于线粒体自噬的缺乏、线粒体中ROS的聚集、由ROS诱导基因产生的ROS过多所致。在晚期阶段通过应用BafA1或氯喹抑制自噬将导致乳腺上皮细胞分化的完全终止,提示在乳腺上皮细胞分化过程中自噬、线粒体自噬和能量代谢之间保持平衡十分必要。保持自噬各要素间的平衡对于乳腺功能和腺体分化十分必要,因为腺腔细胞自噬的增加将会减少细胞的凋亡,这些细胞的死亡有利于促进乳腺导管中空腺腔的形成。

2 自噬抑制BC的发生、进展及转移

通常自噬机制有助于保护正常细胞免于在遭受各种内在、外在应激时导致的DNA不稳定和基因突变,避免受损细胞发生肿瘤前改变和异常增殖。促瘤性应激因素还可以通过自噬通路而得到化解,如蛋白质聚集、产生癌蛋白、线粒体失能产生ROS等。自噬还具有免疫保护功能,因为其参与了癌基因所致的病原控制、炎症调控,参与抑制细胞恶变、免疫反应提升,如支持抗原递呈等过程。自噬对于保持细胞的完整性和保护细胞免于发生癌变非常重要。在癌症的起始阶段,自噬因其细胞保护的角色而被认为具有肿瘤抑制效应,证据是在正常乳腺中观察到自噬相关基因标志物的增加,而在BC进展过程中逐渐减少,乃至丢失。

Beclin 1是Ⅲ型 PI3K复合体的成分之一,参与了自噬的核裂解环节,是首个发现的ATG蛋白,其缺失后和BC的发生有关。增加Beclin 1的活性可以减少其与凋亡抑制因子Bcl-2的结合活性,自噬诱导多肽Tat-Beclin 1的产生会抑制HER2阳性BC细胞异种移植的进展[12]。与Beclin 1+/-小鼠相比,在前驱癌基因WNT1驱动的BC模型中Beclin 1+/+小鼠的成瘤能力显著增强[13]。在单等位基因Beclin1缺失的情况下乳腺细胞出现调节失控,产生更具侵袭性的基底样和三阴性乳腺癌(triple negative breast cancers,TNBC)样BC,这在WNT1驱动的BC模型中得到了证实。自噬还参与癌基因信号通路的调节,如通过降解癌基因Notch1的胞内区,静默Beclin1基因降低TNBC细胞株的克隆形成能力与锚定生长能力。自噬和Beclin 1蛋白的活性有助于保持转化细胞的癌基因信号通路,BC中大多数自噬的肿瘤抑制作用归功于Beclin1基因。Beclin1甚至通过E-cadherin的胞浆、胞膜转位抑制BC细胞MCF-7的增殖、转移和侵袭[14]。

叉头框O(forkhead Box O,FOXO)转录因子具有抑制肿瘤、调节细胞稳定性、稳定干细胞以及延缓衰老等功能,这些功能都和自噬的启动有关。研究显示FOXO3表达增加会诱导参与自噬启动复合体的ATG蛋白的增加,以及自噬小体形成蛋白如ATG5、ATG10、ATG14和GABARAP的增加;同样FOXO3的丢失将减少许多ATG的表达,导致自噬活性的减低。FOXO3的表达缺失将诱导乳腺肿瘤的形成,提示削减FOXO3介导的自噬将导致BC的形成[15]。

通过抑制RAS基因而诱导自噬,进而抑制BC的增生及血管生成[16]。在PyMT诱导的BC小鼠模型中,通过静默MAP1LC3或Beclin1抑制自噬则可以减少cyclin D1、integrin-β1和磷酸化原癌基因酪氨酸蛋白激酶的表达,后者通过减少细胞进入G1期而保持细胞周期,从而促进BC的发生和进展[17]。

将小鼠乳腺肿瘤细胞株工程化,使其失去自噬能力,然后注入大鼠体内,通过灭活自噬基因ATG5或ATG12使其失去自噬能力,结果表明自噬缺陷BC细胞形成显著的、更大的、含有更多增殖细胞的转移灶,而自噬功能完整的细胞则不会如此。和原发肿瘤相比,自噬缺陷BC细胞也可以形成更大的转移灶,提示自噬可以抑制BC细胞的转移[18]。自噬是如何抑制转移灶生长的呢?自噬缺陷细胞显示一种更不成熟的信号,这和其较强的转移潜能和侵袭能力有关。进一步研究显示自噬缺陷转移灶的瘤细胞表达基底样细胞标志物CK14,说明瘤细胞处于一种更原始的状态。而原发的自噬缺陷肿瘤也显示CK14阳性的基底样细胞表型,伴随着较高的增殖活性,类似于转移灶。自噬缺陷原发瘤细胞如果CK14阴性则增殖活性较低,提示自噬会影响BC瘤细胞的增殖。自噬是如何抑制瘤细胞转移的呢?研究显示关闭自噬后导致自噬负荷受体的聚集,后者通过扮演信号支架的角色而改变细胞的命运[19]。Marsh等[18]的研究进一步显示自噬缺陷细胞中自噬负荷受体NBR1和P62聚集将影响瘤细胞对转移部位的选择,NBR1表达缺失将完全消除自噬缺陷对转移部位和表达CK14的基底样细胞的影响,提示自噬抑制瘤细胞转移可能是通过抑制NBR1的聚集所致。某些吡咯衍生物通过诱导细胞自噬而抑制BC的发生。类泛素修饰子活化酶5(ubiquitin-like modifier-activating enzyme 5,UBA5)在BC细胞中上调,体外实验显示UBA5能够阻断BC细胞株MDA-MB-231的细胞周期,诱导自噬及胞浆内质网的应激,进而抑制BC细胞的进展和增殖[20]。

通过活化RIP1介导的AKT/mTOR信号通路促进自噬小体形成,抑制自噬小体的降解,从而在体外抑制BC细胞的增殖,进而抑制BC细胞迁移和转移的作用[21]。外源性BMP9通过cMyc/SNHG3/mTOR信号轴促进自噬的产生进而抑制MDA-MB-231BC细胞的迁移和侵袭[22]。

3 自噬促进BC的发生、进展和转移

自噬过强将会对BC细胞造成损害,因为自噬是一种分解代谢的细胞过程,最终会导致细胞死亡。诱导自噬可作为促进BC细胞死亡的策略之一,类似于化疗和激素治疗。自噬在BC转移和进展过程中的作用,是通过解附细胞外基质与肿瘤细胞的结合,支撑肿瘤细胞存活而促进BC细胞的转移,这是BC细胞转移和迁徙的第一步。

瘤细胞扩散是BC转移的前提,BC主要转移至骨、肺、脑和肝脏等器官,是造成BC患者死亡的主要原因。在肿瘤的迁移过程中,细胞移动性的失调如迁移和侵袭能力的增加是导致其扩散的主要原因。转移机制包括上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT),在此过程中上皮细胞启动一系列分子改变,造成细胞间失连接、细胞极性丧失,最后引起间质表型改变,瘤细胞迁移、侵袭能力增强[23]。BC EMT中重要的调节因子是趋化因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6),它在乳腺组织中表达较为丰富,IL-6通过JAK激酶(Janus kinase,JAK)/STAT信号通路、MAPK信号通路诱导EMT,造成瘤细胞朝向间质表型的分子重新编程,减少E-cadherin的表达及EMT相关因子如TWIST、SNAIL、N-cadherin和基质金属蛋白酶9的表达。自噬可以强烈调节IL-6的分泌,提示BC细胞、肿瘤微环境细胞中的自噬活性可以通过IL6/STAT和IL6/MAPK信号通路调节EMT,从而促进BC的转移、侵袭[24]。

细胞黏附与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)也是BC细胞迁移和侵袭的关键步骤,局灶黏附复合体包含细胞骨架和信号蛋白如连接素、桩蛋白、vinculin和局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)。局灶黏附复合体具有信号转导功能,能够调节瘤细胞的动力、结构和命运。瘤细胞迁徙过程中观察到自噬小体与局灶黏附复合体的局部解离,提示自噬参与了局灶黏附复合体的解体。研究显示在BC中自噬通过静默ATG7或ATG12导致局灶黏附复合体的体积增大,瘤细胞迁移速度下降,提示自噬也可以通过稳定局灶黏附复合体而减少癌细胞的迁徙。静默ATG5或ATG7导致桩蛋白的聚集抑制了自噬,同时增加了瘤细胞的运动能力。通过静默MAP1LC3或Beclin1通路抑制自噬造成整合素β1信号通路的不稳定阻断了SRC激酶的活性及尿激酶型纤溶酶原激活剂表面受体-尿激酶型纤溶酶原激活剂系统,这是细胞迁移和侵袭的重要通路,据此自噬通过促进Hippo信号通路的癌基因效应因子的核转位诱导TNBC癌细胞的迁移和侵袭[25]。

自噬还可以诱导BC细胞产生化疗药物抗性而促进BC的转移、复发、侵袭,体内外研究显示通过抑制自噬将使BC细胞重新获得对化疗药物的敏感性,这主要是通过激活AKT/mTOR信号通路和TAK1/MAPK信号通路而实现[26]。

在MCF7 BC细胞中,含蛋白质的死亡效应结构域(death effector domain containing protein,DEDD)能够抑制自噬,导致SNAIL和TWIST的聚集,进而促进EMT,促进BC细胞的迁移。而在高侵袭性BC细胞株MDA-MB-231中异位表达DEDD则诱导自噬依赖的SNAIL和TWIST基因降解及EMT过程的减弱。在BC细胞中早期自噬激酶(Unc-51样自噬激活激酶1)的下调能够减少线粒体自噬,导致线粒体失能而产生过多的ROS,引起ROS介导的炎症小体增加,引起破骨细胞中细胞因子的释放,造成更广泛的骨转移[27]。雌激素受体β(estrogen receptors,ERβ)通过直接活化CLDN6诱导CLDN6介导的自噬,抑制BC细胞的迁移和侵袭,作为BC的抑制基因,CLDN6在体内外通过自噬通路能够抑制BC的转移[28]。3-MA抑制自噬将增加BC细胞的迁移和侵袭,而通过增加LC3和Beclin 1的表达可以逆转此过程[29]。

总之,自噬在涉及EMT和局部粘附斑逆转的迁移过程中作用关键,然而自噬是促进还是抑制BC细胞迁移取决于瘤组织的周围环境。同时自噬作为一个分解代谢过程对保持细胞稳定和完整性是必需的,在健康的乳腺细胞中它的大部分功能是肿瘤抑制,而在肿瘤形成后则可以促进肿瘤的进展、转移。针对自噬采取靶向治疗能够改善BC患者的预后。

4 自噬与TNBC

根据BC中ER、PR的表达、HER-2状态及Ki-67指数可以将其分为4个分子类型,即:luminal A型,luminal B型,HER2过表达型和TNBC,每种类型的治疗方法有所不同,预后也不尽相同。TNBC占所有BC的10%左右,对各种治疗都不敏感,是所有BC中预后最差的分子类型。

和非肿瘤组织相比,ATG7蛋白表达水平在TNBC中较低,ATG7高表达降低了TNBC细胞的增殖和糖代谢,因此高表达ATG7的TNBC患者总体生存率较高,提示某些ATGs可能发挥抑制TNBC进展的作用[30]。糖酵解和谷氨酰胺分解的关键酶谷丙转氨酶2 (glutamate pyruvate transaminase 2,GPT2)在TNBC中显著高于瘤周组织,彻底灭活该酶会导致TCA循环中间体的减少,引起葡萄糖碳原子的重新连接,其减少还会影响rapamycin 复合体1的活性及诱导自噬,异种移植瘤模型显示GPT2水平减低诱导自噬增加和BC生长增速,因此自噬在TNBC进展中发挥着重要作用[31]。

也有研究显示自噬标志物的表达与ER、PR或HER-2的表达没有关系,调节这些基因可能是不同的、独立的分子通路[32]。自噬相关基因LC3B高表达和TNBC患者预后差、侵袭性强密切相关[33]。缺氧诱导自噬的产生进而促进BC细胞的存活及触发化疗抵抗,高表达缺氧诱导因子1α、miR-210和Beclin 1及低表达 Bcl-2与TNBC患者预后差、对新辅助化疗反应差密切相关[34]。

5 小结

自噬在BC中的作用是“好”还是“坏”还存在争议,因此需要更多的研究以证实自噬对BC的发生、进展、转移、复发究竟是促进还是抑制,明确自噬在BC进展中的机制也有助于优化治疗决策,采取抑制或诱导自噬的策略以更好的治疗BC。自噬相关基因标志物是BC患者无复发生存的独立预后因素,联合应用自噬相关危险评分和临床病理特征可以预测BC患者的3 a和5 a无复发生存率[35]。

自噬在BC中的作用因BC的不同分子亚型而不同,如依赖Beclin1基因诱导的自噬会抑制luminal样BC细胞的肿瘤形成及瘤细胞增殖,而高侵袭性的TNBC常为更强的致癌基因信号通路所驱动而需要依赖/不依赖锚定通路的增殖方式。即使对于同一亚型的BC病例自噬也具有相反的或环境依赖性的作用,这也提示我们不能简单的把自噬与BC的分子类型关联,病变的不同阶段及其作用特点需要重新定义,需要重新审视自噬在BC中的真正作用。多数研究结论是在体外或小鼠模型中获得的,更为精准的、更为特异的自噬调节的临床试验和研究将为患者的临床治疗提供益处。同时鉴于BC的异质性,且BC的治疗是一个长期的过程,在BC产生、进展、复发、转移、播散、治疗过程中可能需要研究特定的或不定的自噬调节因子,因此需要尽最大可能去发掘自噬标志物、去研究机体在肿瘤不同阶段的自噬状态、去研究自噬影响机体对肿瘤的免疫反应,达到联合治疗BC、预判BC预后的目的。特异的自噬调节药物也有助于研究者和临床肿瘤专家预测BC患者早期和晚期自噬调节药物的个体化疗效。