外源ALA 对番茄幼苗盐胁迫的缓解效应

牛 钰，王俊文，李瑞瑞，田 强，武 玥，郁继华，2

（1.甘肃农业大学园艺学院 兰州 730070；2.省部共建干旱生境作物学国家重点实验室 兰州 730070）

目前，生态环境保护已经成为全球重点关注的问题，土壤次生盐渍化是生态环境逐渐恶化的结果之一。据统计，在全世界可耕种的土地面积中，盐渍化面积占可耕种面积的10%，已经严重限制了农业、畜牧业以及林业的发展[1]。在高盐土壤中，植株根系生长受到抑制，叶片明显变黄，光合色素含量均显著下降，抗氧化酶活性以及丙二醛和过氧化氢含量均显著升高[2]。已有学者提出对当前品种的基因型或耐盐性进行遗传改良是解决盐胁迫问题的有效方法[3]。因此，找到减轻土壤盐渍化对作物栽培生产的不良影响的有效方式和途径是一个亟待解决的问题。

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）最初由David Shemin 等[4]于1953 年在禽类动物的血液中发现，被认为是原卟啉的合成前体。近年来，ALA 作为一种植物生长调节剂被许多研究证明能够促进植物生长发育并对植物遭受的环境胁迫具有缓解作用。在干旱胁迫下，喷施外源ALA 使玉米幼苗的形态指标、叶绿素含量以及光合参数显著提高，叶片中丙二醛、过氧化氢含量显著下降，抗氧化酶活性以及抗氧化酶基因相对表达量进一步提高，从而提高了玉米幼苗的抗旱性[5]。在盐胁迫下，外源ALA 可以促进酸枣幼苗叶绿素的合成，促进幼苗生长[6]。在低温胁迫下，外源ALA 促进了枇杷叶片AsA-GSH 的有效循环，增强细胞的抗氧化性，提高枇杷幼苗的耐寒性，且存在浓度效应[7]。还有研究表明，番茄果实成熟过程中施用适宜质量浓度外源ALA（200 mg·L-1）不仅能够改善果实的风味品质，还能够提升果实的外观品质，使果实的成熟期提前[8-10]。

利用植物生长调节剂缓解蔬菜作物逆境损伤是实际生产中一种重要的农艺措施，同时也是提高植物抗性研究的热点方向。在前人研究中，已有外源植物生长调节剂（如2’4-表油菜素内酯、CO、H2S等）提高番茄耐盐性的报道[11-13]，但有关外源ALA在番茄盐胁迫条件下对抗氧化防御系统及渗透调节系统调控的研究较少。笔者以番茄幼苗为试材，采用100 mmol·L-1NaCl 模拟中度盐胁迫，同时喷施不同浓度外源ALA，研究其对番茄幼苗氧化损伤及抗逆性的影响，以期为ALA 缓解蔬菜作物非生物胁迫的实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试番茄品种为以色列大红宝，种子购自甘肃省农业科学院。该品种属于矮秧自封大红果，早熟性突出、花芽分化好、坐果集中、果实高圆形、大红有光泽、无绿肩、皮厚耐贮运，抗裂果、抗病抗逆能力强。ALA 及其他化学药品由甘肃源昕生物科技有限公司提供。

1.2 试验设计

试验于2021 年10—12 月在甘肃农业大学园艺学院人工气候室内进行。在50 孔穴盘内育苗至4 叶1 心时移栽至高20 cm、直径30 cm 栽培盆中，浇灌1/4 山崎营养液，培养过程中每12 h 进行1 次昼夜交替，设置光照度（20 000 lx/0 lx）和温度（28 ℃/18 ℃），以昼夜交替为周期，相对湿度为75%，移栽1 周后进行处理。根据邹志荣课题组Cao 等[14]已筛选的番茄幼苗中度盐胁迫浓度，本试验中每隔2 d 根部浇灌1 次100 mmol·L-1NaCl 溶液模拟盐胁迫，12 h 后在黑暗条件下叶面喷施不同质量浓度ALA 溶液（0、25、50 mg·L-1），持续处理7 d 后进行相关指标的测定，每个处理3 次重复，每个重复40 株幼苗。采用随机区组设计方法，试验设以下处理：（1）CK：正常栽培条件；（2）NaCl：浇灌100 mmol ·L-1NaCl 溶 液；（3）25 A + N：浇 灌100 mmol·L-1NaCl 溶液，叶面喷施25 mg·L-1ALA溶液；（4）50 A+N：浇灌100 mmol·L-1NaCl 溶液，叶面喷施50 mg·L-1ALA 溶液。

1.3 指标测定方法

处理7 d 后进行以下指标的测定，每个指标3次重复，每个重复5 株幼苗。

1.3.1 植株形态及生长指标的测定 番茄根系用根系扫描仪（STD 4800，加拿大）扫描并用根系分析软件Win RHIZO 5.0（Regent Instruments，Inc.，加拿大）对根系进行分析，进而获得根系形态指标（根长、根表面积、根系直径、根体积、根尖数、分根数）。植株总叶面积使用叶面积仪（YMJ-C，浙江托普有限公司，中国）进行测定。

1.3.2 植株生物量的测定 处理7 d 后，仔细冲洗植株根部，用滤纸擦干表面水分。分别称取地上部和地下部鲜质量，之后放入烘箱中烘干至恒质量，分别称取地上部和地下部干质量。

1.3.3 根系活力测定 采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法测定根系活力[15]。称取0.5 g 根，加入10 mL 0.4%TTC 和0.1 mol·L-1pH 7.5 的磷酸缓冲盐溶液（PBS），37 ℃条件下保温1 h，加入2 mL 1.0 mol·L-1H2SO4。取出根并擦干后加3～5 mL 乙酸乙酯和少量石英砂，研磨，过滤。在485 nm 下测定OD 值。根据以下公式计算根系活力：

1.3.4 丙二醛（MDA）含量的测定 采用硫代巴比妥酸比色法测定MDA 含量[16]。称取0.8 g 新鲜叶片，加入少量10%三氯乙酸溶液（TCA）和石英砂研磨至匀浆，使用10%TCA 定容至10 mL，然后再离心。取2 mL 上清液转入10 mL 离心管，加入2 mL含有0.6% TBA 的10% TCA 溶液，沸水水浴20 min，冷却后离心，在450、532、600 nm 波长下测定OD 值。采用以下公式计算MDA 含量（b，后同）：

b（MDA）/（μmol·g-1）=

0.25×6.45×（OD532-OD600）-0.56×OD450。（2）

1.3.5 叶绿素含量的测定 参考钟淮钦等[17]的方法，准确称取0.1 g 新鲜叶片，放入25 mL 具塞试管中，加入10 mL 80%丙酮，黑暗下浸提48 h 至叶片呈白色，于663、645、440 nm 下测定OD 值。根据以下公式计算叶绿素含量（w，后同）：

1.3.6 抗氧化酶活性的测定 称取0.5 g 新鲜叶片，加入0.1 g PVP 和少量石英砂，加1 mL 0.05 mol·L-1pH 7.8 的PBS 缓冲液冰浴研磨至匀浆，加入4 mL 0.05 mol·L-1pH 7.8 的PBS 缓冲液，摇匀后离心，上清液即为总酶液。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定参考李荣等[18]的方法。

1.3.7 渗透调节物质含量的测定 可溶性蛋白和脯氨酸含量的测定参考徐宁等[19]的方法。称取0.8 g 新鲜叶片，加8 mL 3%磺基水杨酸溶液，沸水浴中浸提10 min。冷却后，吸取上清液2 mL，加2 mL 冰醋酸和3 mL 酸性茚三酮显色液，沸水浴40 min，冷却后加5 mL 甲苯。静置分层后吸取甲苯层在520 nm 波长下测定OD 值。根据以下公式计算脯氨酸含量：

称取0.5 g 新鲜叶片，加入0.1 g PVP 和石英砂，加1 mL 0.05 mol·L-1pH 7.8 的PBS 缓冲液冰浴研磨，加4 mL 0.05 mol·L-1pH 7.8 的PBS 缓冲液，离心。取0.1 mL 上清液，加入0.9 mL 蒸馏水、5 mL考马斯亮蓝G-250 试剂，在595 nm 下测定OD值。根据以下公式计算可溶性蛋白含量：

1.4 数据分析

使用Microsoft Excel 2019（Microsoft 公司，美国）分析数据和作图，利用SPSS 22.0（SPSS Institute Inc.，美国）软件LSD 和Duncan’s 检验法对数据进行多重比较，显著性水平设为p＜0.05。

2 结果与分析

2.1 外源ALA 对盐胁迫下番茄幼苗根系生长的影响

由表1 可知，与正常水平相比，盐胁迫下番茄幼苗根系直径增加了15.5%，根长、根表面积、根体积、根尖数、分根数和根系活力分别减少了36.8%、31.6%、33.9%、37.5%、42.7%和9.6%。盐胁迫下番茄植株根系生长弱，侧根稀疏（图1-B），同时促进其根系的横向生长。喷施25 mg·L-1ALA 后根长、根表面积、根体积、根尖数、分根数和根系活力分别比盐胁迫提高了140.27%、133.03%、152.98%、65.19%、227.94%和28.86% ，根系直径比盐胁迫减小了5.32%。25 mg·L-1ALA 显著逆转了盐胁迫造成的生长抑制，根系发达（图1-C），缓解了盐胁迫导致的根系横向生长。

图1 外源ALA 对盐胁迫下番茄幼苗根系结构建成的影响Fig.1 Effect of exogenous ALA on root structure formation of tomato seedlings under salt stress

表1 外源ALA 对盐胁迫下番茄幼苗根系形态参数的影响Table 1 Influence on of root morphological parameter of exogenous ALA on salt stress of tomato seedlings

2.2 外源ALA 对盐胁迫下番茄幼苗叶片生长的影响

如图2 所示，盐胁迫下叶片表面积与CK 相比显著降低了33.9%，喷施25 mg·L-1ALA 使叶片表面积比正常水平和盐胁迫分别显著提高了23.8%和87.2%，喷施50 mg·L-1ALA 时叶片表面积与正常水平无显著差异。盐胁迫下叶片少且局部有黄色斑点，顶部叶片展开异常并且形状不规则（图3-B），喷施ALA 后植株叶色绿，顶部叶片正常展开且叶片数多（图3-C～D）。

图2 外源ALA 对盐胁迫下番茄幼苗叶片表面积的影响Fig.2 Effect of exogenous ALA on leave surface area of tomato seedlings under salt stress

图3 外源ALA 对盐胁迫下番茄幼苗叶片形态建成的影响Fig.3 Effect of exogenous ALA on leave morphological formation of tomato seedlings under salt stress

2.3 外源ALA对盐胁迫下番茄幼苗生物量的影响

由表2 可知，与CK 相比，盐胁迫使植株地上部鲜、干质量分别降低了24.9%、17.6%，对地下部生物量的抑制作用并不显著。盐胁迫下喷施25 mg·L-1ALA 使地上部干、鲜质量保持在正常水平，地下部鲜、干质量分别比CK 提高了85.7%、117.8%。盐胁迫下喷施50 mg·L-1ALA 使地上和地下部鲜干质量均保持在正常水平。

表2 外源ALA 对盐胁迫下番茄幼苗生物量的影响Table 2 Effect of exogenous ALA on biomass of tomato seedlings under salt stress

2.4 外源ALA 对盐胁迫下番茄幼苗MDA 含量的影响

如图4 所示，盐胁迫处理后番茄幼苗MDA 含量比CK 植株显著增加了28.1%，说明盐胁迫导致番茄幼苗活性氧积累，加速了膜脂质过氧化。盐胁迫下喷施外源ALA 使番茄幼苗MDA 含量显著降低到正常生长水平；喷施25 mg·L-1ALA 和50 mg·L-1ALA 后，MDA 含量与盐胁迫相比分别降低了20.4%、20.9%，ALA 能显著缓解盐胁迫对植株造成的氧化胁迫，抑制MDA 的生成。

图4 外源ALA 对盐胁迫下番茄幼苗丙二醛含量的影响Fig.4 Effect of exogenous ALA on MDA content of tomato seedlings under salt stress

2.5 外源ALA对盐胁迫下番茄幼苗叶片叶绿素含量的影响

如图5 所示，盐胁迫使番茄幼苗叶绿素a（Chla）和叶绿素b（Chlb）含量显著低于正常水平。喷施25 mg·L-1ALA 后植株Chla 含量和Chlb 含量达到最高，分别比正常水平显著提高了13.9%和8.7%。然而，喷施50 mg·L-1ALA 后Chla 含量和Chlb 含量降低到正常水平。植株总叶绿素含量（ChlT）随盐胁迫和外源ALA 的变化趋势同Chla 和Chlb。盐胁迫显著提高番茄幼苗类胡萝卜素（Car）含量。盐胁迫下喷施25 mg·L-1ALA 使植株Car 含量降低到CK 水平，喷施50 mg·L-1ALA 时Car 含量最低。说明盐胁迫对番茄幼苗Car 含量影响显著，而且高浓度的ALA 反而对Car 含量有显著抑制作用。

图5 外源ALA 对盐胁迫下番茄幼苗叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量的影响Fig.5 Effect of exogenous ALA on chlorophyll a,chlorophyll b,total chlorophyll and carotenoid content of tomato seedlings under salt stress

2.6 外源ALA对盐胁迫下番茄幼苗抗氧化酶活性的影响

由图6 可知，番茄幼苗受到盐胁迫后其体内的SOD 活性与正常水平相比提高了50.5%，盐胁迫下喷施25 mg·L-1ALA 时SOD 活性与盐胁迫相比无明显差异，喷施50 mg·L-1ALA 后SOD 活性比正常水平和盐胁迫分别降低了38.9%、59.4%，说明高浓度ALA 显著抑制SOD 活性。盐胁迫下番茄幼苗中POD 活性比正常水平显著降低了29.9%，但喷施25 mg·L-1ALA 后，POD 活性与盐胁迫下和正常水平相比分别显著提高了64.1%、15.0%，喷施50 mg·L-1ALA 后，POD 活性降低到了正常水平。盐胁迫下CAT 活性比正常水平显著降低了75.5%，而外源不同浓度的ALA 也没有提高其活性，始终保持在胁迫水平下的活性。盐胁迫下APX 活性与正常水平相比显著降低了44.4%，25 mg·L-1ALA 将APX 活性提高到正常水平，比盐胁迫水平提高了80.6%，50 mg·L-1ALA 又降低了APX 活性。

图6 外源ALA 对盐胁迫下番茄幼苗SOD、POD、CAT和APX 活性的影响Fig.6 Effect of exogenous ALA on SOD,POD,CAT and APX activity of tomato seedlings under salt stress

2.7 外源ALA对盐胁迫下番茄幼苗渗透调节物质含量的影响

由图7 可知，盐胁迫下番茄幼苗中可溶性蛋白和脯氨酸含量分别比CK 植株提高了12.9%和413.0%，喷施25 mg·L-1ALA 后可溶性蛋白和脯氨酸含量比胁迫条件下显著降低了10.9%和54.1%，而脯氨酸含量比CK 显著提高了135.6%。同时，与CK 相比，喷施50 mg·L-1ALA 使植株可溶性蛋白含量和脯氨酸含量显著提高。

图7 外源ALA 对盐胁迫下番茄幼苗渗透调节物质含量的影响Fig.7 Effect of exogenous ALA on osmotic adjustment substances content of tomato seedlings under salt stress

3 讨论与结论

根系是植物感应土壤盐分的主要部分。已有研究表明，番茄幼苗在不同浓度盐胁迫下植株的根系生长指标均显著低于正常水平[20]，叶片生长受阻[21]，海滨雀稗根系投影面积和根表面积显著降低、根系直径增大[22]，黑云杉和油松植株粗根的百分比增加，细根的百分比减少[23]。本试验结果表明，盐胁迫下，番茄植株根系直径增大，其余根系生长指标和叶片生长均受抑制，与上述研究结果一致。此外，不同胁迫（铬胁迫、盐胁迫和干旱胁迫）下较低质量浓度（5、25 mg·L-1）ALA 均能提高草地早熟禾根长等，而较高质量浓度（50、100 mg·L-1）的ALA起抑制作用[24]。前人研究与本试验结果一致表明，外源ALA 有效缓解盐胁迫导致的植株根系和叶片生长受阻，且表现为浓度效应。

根际盐胁迫下植株体内细胞受到氧化胁迫而使植株生长缓慢或死亡[25]，许多研究报道[26-28]证实ALA 能提高环境胁迫下植株的干质量和根系活力。在本试验中，中度盐胁迫阻碍了植物的正常生长，使其地上部干鲜质量和根系活力降低，然而，25 mg·L-1的外源ALA 提高了植株根系活力和干物质积累量。有学者报道，ALA 处理显著增强了盐胁迫下的草莓植株根系SOS1、NHX1和HKT1基因的上调表达，促进了根系中Na+的固存，并减少了叶片中Na+积累[29-30]。此外，宋佳倩等[31]也已证明，盐胁迫增强烟草幼苗Na+吸收和K+外排，外源麝香草酚可逆转此现象。推测在本试验中，外源ALA 通过提高盐胁迫下番茄幼苗根系活力，进一步促进K+吸收，Na+外排，使地上部Na+含量降低，减轻盐害，促进植株生长及干物质积累。

叶绿素是一种重要的光合色素[32]。盐胁迫下叶绿素合成受到显著抑制并促进其快速降解为类胡萝卜素，从而影响植物的光合作用[33-34]。已有研究证明，盐胁迫下叶绿素合成分支中编码镁螯合酶的基因（CHLH）转录水平下调，叶绿素合成受抑制[35]。在本试验中，盐胁迫下调了叶绿素含量，与此同时，Car 含量增加，这与前人研究结果一致。武玥[36]的研究表明，中度盐胁迫导致的黄瓜幼苗叶绿素合成受到抑制，能够被外源ALA 处理缓解。此外，镉胁迫下施加2 mg·L-1ALA 使油菜下胚轴长度增加，但施加10 mg·L-1ALA 使下胚轴长度显著降低[37]。这与笔者的研究结果一致，外源ALA 同样表现出浓度效应，即在胁迫条件下，25 mg·L-1ALA 能够逆转中度盐胁迫造成的生长抑制，而50 mg·L-1ALA 反而抑制了生长。这可能是由于较高剂量的ALA 加速了氧化损伤，破坏了膜的完整性，降低了光合作用[38]。有学者研究证明高浓度ALA 可以作为除草剂使用[39]。

胁迫下植株体内细胞的损伤程度可以用MDA含量来衡量[40]。外源ALA 是一种强效的抗氧化剂，可通过清除在不同环境胁迫下产生的活性氧（ROS）来减轻氧化损伤，如高盐[41]、干旱[42]和重金属[43]胁迫。在Youssef[44]的研究中证明，外源ALA 有效缓解了盐胁迫造成的高粱植株MDA 大量积累。本研究结果与上述结果一致，番茄幼苗受到盐胁迫后，其叶片中MDA 含量显著升高，对细胞膜造成了严重的氧化损伤，然而，外源ALA 将MDA 含量降低到正常水平，有效缓解了盐胁迫。

SOD、POD、CAT、APX 等组成的植物抗氧化系统可参与大量ROS 的清除，与植物的抗逆性密切相关[45-46]。SOD 通过催化超氧阴离子自由基歧化为过氧化氢和氧气，进而解除其毒性，而POD、CAT、APX 负责清除解毒过程中所产生的过氧化氢[47]。在本试验中，盐胁迫下SOD 活性增强，POD、CAT、APX 活性降低，说明SOD 作为抗氧化的第一道屏障，将活性氧分子歧化生成H2O2，而歧化产物未能完全被消除，造成了更大程度上的氧化损伤。然而，25 mg·L-1ALA 可提高POD 和APX 的活性，逆转胁迫造成的氧化损伤。Ali[48]的研究结果与此一致，玉米植株体内POD、CAT、APX 活性受盐胁迫而显著降低。此外，吕婷婷等[49]的研究结果表明，盐胁迫下适宜质量浓度的ALA（16.7 mg·L-1）处理显著提高了菘蓝幼苗SOD 和POD 活性。前人和本试验的研究结果一致表明，ALA 可通过提高抗氧化酶活性缓解盐胁迫造成的氧化损伤，且有浓度效应。

渗透调节物质（如可溶性蛋白和脯氨酸）在逆境胁迫条件下对植物起保护作用[50]。盐胁迫使花生叶片中积累了大量脯氨酸，10 mg·L-1ALA 可有效降低其积累量并将其含量维持在较低水平[51]。本试验结果显示，盐胁迫使植株可溶性蛋白和脯氨酸含量大幅提高，25 mg·L-1ALA 处理后其含量与胁迫条件相比显著下降，然而50 mg·L-1ALA 处理下可溶性蛋白含量又增加到盐胁迫下的水平，说明番茄幼苗能够通过可溶性蛋白和脯氨酸的积累进行盐胁迫条件下的渗透调节，外源施用适宜质量浓度ALA（25 mg·L-1）可以有效缓解盐胁迫，细胞内渗透胁迫减轻，植株内渗透调节物质积累量也随之降低，喷施高质量浓度ALA（50 mg·L-1）反而增加可溶性蛋白含量，说明ALA 对植株作用存在浓度效应，高浓度会对植株造成损伤，其作用效果与环境胁迫相同。

综上所述，以100 mmol·L-1NaCl 模拟中度盐胁迫，研究不同浓度外源ALA 对番茄幼苗盐胁迫的缓解效应。结果表明，25 mg·L-1ALA 促进植株生长及生物量增加，叶绿素含量提高，POD 活性提高，脯氨酸含量降低，APX 活性、可溶性蛋白和MDA 含量达到正常水平；50 mg·L-1ALA 缓解效应不佳甚至抑制植株生长，表现为浓度效应。综上，25 mg·L-1ALA 可有效缓解番茄幼苗盐胁迫的影响。