代谢组学在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的研究进展

王治财，仓彦

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）是全球诱导人死亡的主要疾病［1］。复杂的分子机制是心血管疾病发病的主要特征，代谢紊乱参与心血管疾病的进展，促使人们运用代谢组学去研究冠心病的发病机制及疾病进展过程，通过代谢组学在临床病人中识别生物标志物及致病通路，再通过基础医学研究证明差异代谢物或通路的机制，最终运用于临床诊断和治疗。

代谢组学是对生物系统中代谢物的定性和定量组成的研究［2］，应用代谢组学去识别疾病中的生物标志物变得越来越流行。近年来代谢组学在识别冠心病生物标志物方面取得了很大的进展，但是仍然不充分。对于急性冠脉综合征病人，通过对代谢物的检测发现了肌红蛋白，肌钙蛋白I 和肌钙蛋白T 等标志物，可以通过这些生化指标对急性心肌梗死病人进行诊断，但是心肌肌钙蛋白作为诊断心肌损伤的特异度生化标志物，灵敏度高，特异度低，且只能在症状出现后至少6 h 才能达到峰值，造成了心肌标志物的不理想，对于慢性冠脉疾病病人尚未有显著的诊断性生物标志物应用于临床。因此我们期待利用代谢组学发现心血管疾病新的标志物，优化生物标志物对冠心病的诊断标准。

疾病的发病机制和诊断疾病的生物标志物可以通过人体体液代谢谱来实现，如果通过代谢组学准确地表征冠心病特征，进而可以有针对性地进行治疗，避免使用不必要的治疗手段和资源。

1 冠心病

1.1 冠心病的定义及流行病学特征冠心病是由动脉粥样硬化引起的冠脉管腔狭窄或闭塞的一种缺血性心脏病，主要包括慢性冠脉疾病和急性冠脉综合征，其中慢性冠脉疾病主要有稳定型心绞痛（stable angina，SA）、无症状性冠心病和缺血性心肌病三种类型，急性冠脉综合征（acute coronary syn‑drome，ACS）主要有不稳定型心绞痛（unstable angi‑na，UA）、非ST 段抬高型心肌梗死（non-ST-elevation MI，NSTEMI）和ST 段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction ，STEMI）三种类型［3］。

冠心病是世界范围内严重损害人类健康的疾病，根据2018 年NHIS 调查数据显示估计冠心病在白人中患病率为5.7%，在黑人中患病率为5.4%，在美国印第安人/阿拉斯加土著中患病率为8.6%，在18 岁以上的亚洲人中患病率为4.4%［4］。基于冠心病的高患病率，目前冠心病诊断金标准是冠脉造影，主要治疗手段为经皮腔内冠状动脉成形术、经皮腔内冠状动脉介入术和冠脉搭桥手术，但尚未有能够逆转动脉硬化性疾病的药物。从而促使人们去探索冠心病的机制，以期寻找较为显著的通路和标志物，对冠心病起到更好的治疗作用。

1.2 生物标志物

1.2.1ACS生物标志物 ACS心肌标志物方面已经取得了很大进展，但高死亡率和发病率仍然是世界范围内的首要问题。发现理想的生化标志物有助于对急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）病人早期诊断、个体化治疗、风险评估及预测疾病的预后，从而降低病人的死亡率。

目前主要应用于临床的心脏标志物有肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌红蛋白、TnC、TnI 和TnT。大多数化验指标对AMI 的诊断尚不充分。CK-MB在心肌损伤后4~9 h 开始升高，对诊断AMI 具有参考价值［5］，它的缺点是在早期不能够达到峰值，且存在于恶性肿瘤、肺栓塞、肌肉栓塞等疾病中造成诊断AMI 时产生假阳性的结果。肌红蛋白在AMI 病人中6~10 h 升高是AMI 的敏感标志物，但无特异性［6］。目前参与AMI诊断的最重要的心肌肌钙蛋白（cTn）标志物是TnT、TnI和TnC［7］。但这些标志物的灵敏度高，特异度低，并且在AMI 6 h 后才能出现峰值，因此目前存在的生物标志物仍不够理想。

1.2.2慢性冠脉疾病生物标志物 生物标志物在慢性冠脉疾病病人的诊断方面已经取得很大的进展，可用于识别可能需要预防性治疗的阻塞性心血管疾病病人，然而目前的临床实践指南并不推荐在稳定型冠心病病人的临床实践中常规使用生物标志物进行诊断。除了心肌标志物的诊断作用，它还可以预测慢性冠心病病人发生主要不良心血管事件的风险。Rusnak 等［8］对稳定型心绞痛病人心肌标志物进行综述表明，生物标志物（纤维蛋白原、hs-CRP、脂蛋白相关PA2、脂蛋白a、hs-肌钙蛋白、NT-proBNP 和胱抑素C）可以检测出超过既定风险评分的病人，但是满足这些必要标准的理想生物标志物是不存在的。Mccarthy 等［9］表明，对于临床医生来说，目前稳定型冠心病病人的预后不可预测，利用生物标志物诊断冠心病和预测稳定型冠心病的终点事件是具有挑战性的，研究人员研究了大量的生物标志物对冠心病病人的预后和诊断价值，但在稳定型冠心病病人中使生物标志物从基础研究过渡到临床实践，还需要进一步的临床试验。

2 代谢组学

2.1 概念及实验分析方法代谢组学是对体液中代谢物（小分子<1.5 kDa）的定性和定量评估。代谢物是遗传转录和翻译过程的下游，被认为与疾病表型密切相关。代谢组学包括靶向代谢组学研究和非靶向代谢组学研究。靶向代谢组学研究是用代谢组学方法识别具有调节生物学功能的特定生物通路相关的代谢物［10］，其特征是测量预先确认的代谢物。与靶向代谢组学相比，非靶向代谢组学显得更为流行，它是建立在包含具有良好特征的代谢产物谱作为标准的“代谢产物库”基础上，进行全面性测量比较进而研究多种代谢物［11］，通过筛查差异代谢物将细胞通路与生物机制联系起来，促进了我们对疾病机制的理解，为其临床转化铺平道路。

核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波谱在代谢组学领域有着广泛的应用，不仅适用于液体样品，也适用于固体、气相组织样品［12］。NMR 的优点是样品的可重复利用性、较少受仪器变异性的影响、定量的优势， 主要缺点是灵敏度和分辨率比MS 低、NMR 波谱分析的复杂性［13］。质谱与色谱串联技术平台通常被用于代谢组学的检测中，主要包括液相色谱/质谱法（liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS）、气相色谱/质谱法（gas chroma‑tography/mass spectrometry，GC/MS）及毛细管电泳/质谱法（capillary electrophoresis/mass spectrometry，CE/MS）。其中LC/MS特别是超高效液相色质谱（ul‑tra-high-performance liquid chromatography/mass spectrometry，UPLC/MS）是最广泛使用的方法，主要原因是LC 可用大量可访问的仪器、开源数据、处理软件分离和检测代谢物 ；LC-MS 的缺点是：离子抑制。气相色谱的优势是：分离效率高，保留时间重复性好［14］；缺陷是：易热性分析物的损失、复杂的样品制备、更高的变异性。CE可以应用于非常低的样品量，但是由于CE-ESI 接口的灵敏度较差，目前在商业上已经开发了新的可用接口可用作GC 和LCMS 的补充［15］，因此为这种方法开辟了广阔的前景。与NMR 相比，MS能够测量更多的代谢物数量，具有更高的灵敏度［15］，卓越的色谱分辨率结合高灵敏度的MS 可以在几分钟内检测和测量数千种代谢物的水平。

2.2 代谢组学的优势代谢组学被越来越多地用于识别疾病中的生物标志物、检测疾病中的生物通路变化以及阐述心血管疾病的机制，具有巨大的临床翻译潜力［16-17］。与基因组学相比，基因在生命的整个周期过程中相对稳定，而代谢组学可因环境等多因素改变而改变，每个生物样本的代谢组特征代表特定状态和时间的疾病的写照，从而反应生物体特定时间和状态的疾病特征。代谢组学是一个相对较新的领域［18］，对研究疾病以及对外界刺激的作用和反应条件下的机制具有重要意义［19］。研究疾病代谢物的变化主要优势包括：①在分子水平上增加对疾病病理生理学的理解，并产生新的疾病机制假说；②确定疾病风险预测和诊断的生物标志物；③评估疾病进展；④解释环境和生活方式对疾病的影响；⑤评估药物疗效、毒性和药物不良反应［20］。代谢组学除了在疾病研究中的优势，在获取途径上比遗传研究更容易，用于代谢组学的生物体液或组织可以轻易在病人中取样。

与基因组学和蛋白组学相比，代谢组学的优势是显而易见的，且与疾病的表型最紧密，深入了解代谢物水平的变化能让我们理解受干扰的细胞通路的下游效应［21］。心脏是身体中代谢需求最大的器官，其代谢紊乱导致体液（包括血浆）代谢组的变化，血浆代谢物的变化反映了潜在的心脏疾病进展。通过代谢组学的方法可以很好地抓出心血管疾病特征，定期进行代谢组学的研究，能将冠心病的发展转归勾勒得更加清晰，从而透彻了解其背后的分子机制。

3 代谢组学在冠心病研究中的应用

近年来，代谢组学在心血管领域快速发展，国内外一些研究人员将代谢组学方法应用于心血管疾病。Ali 等［22］采用GC/MS、固相微萃取-气相色谱-质谱联用和1H-NMR 对STEMI、UA 和健康对照组的血清代谢物谱进行分析。多变量数据分析显示，代谢特征能够有力区分STEMI 病人与健康对照组和UA 病人。Würtz 等［23］利用NMR 进行以三组人群为基础的队列代谢组学研究，以确定心血管疾病的生物标志物，4 种代谢物，即苯丙氨酸、单不饱和脂肪酸（MUFA）、ω-6 脂肪酸和二十二碳六烯酸（DHA）与未来心血管事件有关并且指出将这4 种代谢物与已建立的风险因子结合起来，可以改善心血管风险预测。

在靶向代谢组学研究方面，最近的一些研究表明，利用靶向代谢组学分析方法可以有效的测量一组预先选择的、具有化学相关性的、同属某一代谢途径的代谢物。Goulart 等［24］用靶向代谢组学方法，通过UPLC-MS/MS 和基于MS 的流动注射分析（MSbased flow injection analysis，FIA-MS）对STEMI 病人和健康对照组进行代谢组学研究表明，STEMI 病人中磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、鞘磷脂和生物胺的浓度发生了变化并且确定了甘油磷脂，亚麻酸和鞘磷脂代谢的变化。Floegel 等［17］的一项前瞻性队列研究证明靶向代谢组学方法可为健康人群中与心血管疾病高风险相关的早期代谢紊乱提供独特的快照，共研究了105 种血清代谢物与AMI 和缺血性中风风险的相关性。

非靶向代谢组学又称发现代谢组学，相对靶向代谢组学更为流行，其应用通过对疾病组与健康组的差异代谢物的比较，发现一系列有生物意义的代谢物，更好的阐明疾病的机制，具有巨大的临床转化能力。Gundogdu 等［25］用非靶向代谢组学方法，通过用液相色谱四极杆飞行时间质谱法对STEMI 病人和对照组血清代谢物进行差异比较的研究表明，STEMI 病人中的亮氨酸，L-脯氨酸，L-丙氨酸，甘氨酸，延胡索酸，柠檬酸，琥珀酸和肉碱水平下降，丙氨酸，马来酸、丁酸、尿酸、油酸、棕榈酸、LysoPC（18∶2）、甘油乙醇胺、咖啡因和L-乳酸水平升高，证实丙二酸，马来酸、富马酸和棕榈酸可以作为STEMI病人早期风险分层的生物标志物。Surendran 等［26］采用非靶向代谢组学分析LC/MS 方法对27 例STE‑MI病人的血浆进行了分析，将缺血状态下的血浆代谢组与原发性经皮冠状动脉介入治疗后的多个时间点进行了比较，有助于更好地理解人类急性心肌缺血和再灌注过程中所涉及的机制。

近年来国内关于代谢组学在冠心病中的研究也有了突飞猛进的进展，最为大型的研究是齐炼文等［27］通过非靶向代谢组学法研究了2 324 例病人（包括正常冠状动脉、非梗阻性冠状动脉粥样硬化、SA、UA 和AMI 五组受试者）血浆代谢物，并进行交叉比较，共鉴定出89 种差异代谢物，代谢途径的改变包括磷脂分解代谢减少，氨基酸分解代谢增加，短链酰基肉碱增加，三羧酸循环减少，初级胆汁酸生物合成减少。随后采用串联液相色谱-质谱联用及同位素标记的标准添加进行代谢标记N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）的靶向分析，通过体外和体内模型研究Neu5Ac在CAD进展中的作用［28］。

4 小结

综上所述，代谢组学包括从临床获得样本、以实验室为基础进行验证、最终服务于临床实践的过程，具有巨大的临床转化潜力，目前在心血管疾病研究方面还不充分。为了运用代谢组学更全面地研究心血管疾病，需要我们做的是：标准化和协调代谢组学表型和生物标志物建模程序，改进现有的公共数据库，促进数据共享［29-30］。另外，多组学数据结合起来具有更为强大的力量，如结合多组学如基因组学、蛋白组学可以更好的阐述疾病机制［31］，促进人们对复杂疾病的深入了解和更好表征，因此我们展望代谢组学与其他组学的整合在未来几年将越来越多地应用于心血管疾病的研究，增加对心血管疾病机制和病理生理学知识的阐述，识别诊断和风险预测的生物标志物，促进个体化治疗，改善预后。