鸭疫里莫氏杆菌的分离鉴定与药敏试验

文│尹彦昆（山东省阳谷县畜牧兽医事业发展中心）

鸭疫里莫氏杆菌病又被称为鸭传染性浆膜炎，这是一种急性或慢性传染病，主要引起60日龄以内尤其是14～21日龄的雏鸭、火鸡、鹅大量死亡，并造成长期污染，对养殖户的经济效益造成了严重的损害。本试验从调查鸭死亡的原因出发，从病死鸭肝、心脏和脑组织中分离出菌株，并经分离培养、革兰氏染色镜检及生化试验，确定该病菌为鸭疫里莫氏杆菌。为了解目前该地区鸭疫里莫氏杆菌的耐药性进行了药敏试验，为该病的鉴别诊断和预防提供了科学依据。

一、材料与方法

1.材料。

（1）菌株来源。2021年2月，山东省菏泽市两个鸭场寻找传染性浆膜炎病例，发现几只雏鸭具有典型症状。我们将疑似患有鸭传染性浆膜炎的病鸭解剖后发现其肝肿大，浆膜表面纤维素渗出等典型变化。为了进一步确诊，将病鸭的研究器官解剖并带回试验室进一步诊断。

（2）培养基。巧克力培养基（批号20200903）、胰酶大豆琼脂固体培养基（批号20200811）、马丁肉汤培养基（批号20200914）、麦康凯琼脂培养基（批号20200106）均购于青岛海博试剂公司，胰蛋白胨大豆肉汤（批号20210203）购自北京奥博星生物技术有限责任公司，染色试剂盒（批号20201011）购自郑州中天科技有限公司。

（3）药品。选用阿莫西林（批号110151）、庆大霉素（批号1 1 0 3 1 1）、氨苄西林（批号110112）、磷霉素（批号110321）、环丙沙星（批号1 1 0 2 5 6）、多西环素（批号110711）、左氧氟沙星（批号110614）、头孢噻肟钠（批号1 1 0 1 3 1）、头孢曲松钠（批号1 1 0 1 4 2）、亚胺培南（批号110153）、氟苯尼考（批号1 1 0 7 5 9）、头孢吡肟（批号110361）、黏菌素（批号110139）、阿米卡星（批号110251），药物浓度分别为94%、60%、98.5%、60%、93%、83%、89.92%、90%、85%、80%、99.5%、77%、80%、90%。所有药物和微量生化鉴定管均选自青岛微生物试剂有限公司。

2.方法。

（1）细菌分离。在无菌条件下采集病料，将细菌接种在TSA平板（包括5%的胎牛血清）上，并把培养基放置在37℃厌氧袋中培养，43小时后观察细菌生长状态。

（2）鉴别培养。筛选出可疑菌落，在无菌环境下按顺序分别将其划线接种于巧克力培养基、麦康凯琼脂培养基和TSA培养基上，然后在37℃的厌氧袋内培养36小时，对3种不同培养基上细菌的生长情况进行观察。最后挑取具有疑似鸭疫里莫氏杆菌特征的细菌接种于胰蛋白胨大豆琼脂培养基（含5%胎牛血清）上进行纯培养。

（3）革兰染色。对分离培养得到的菌株进行革兰氏染色，步骤如下：选出纯培养具有鸭疫里莫氏杆菌特征的单个菌落，用接种环将其均匀涂在载玻片上，干燥固定；在载玻片上滴加1滴草酸铵结晶紫染色液，染色1分钟后用水冲洗；加入两滴革兰氏碘液，浸染1分钟，再水洗；用过滤纸吸取多余水分，加入95%酒精进行脱色处理1分钟，再次水洗；加沙黄复染1分钟左右用水冲洗，等待干燥后在显微镜下观察细菌结构特征。

（4）生化试验。挑选纯培养的鸭疫里莫氏杆菌，用接种环接种到马丁肉汤培养基中（血清浓度10%），并将其放置在37℃的恒温箱中连续振荡培养24小时，再将培养后的细菌接种于微量生化反应小管中，静置24～48小时，观察试验结果。

糖发酵试验。在无菌条件下，在每只糖发酵小管内放入0.2毫升纯培养的细菌液，观察7天。

过氧化氢酶试验。在无菌条件下，将固体培养基上的菌落用接种环取出置于试管内，滴加2毫升浓度为3%的过氧化氢，观察是否产生气泡。

3.药物敏感性试验。测定每种细菌对每种药物的耐药程度，首先将上述药物按要求配制成初浓度为1280微克/毫升的储备液，再将培养好的菌液稀释1000倍，最后采用微量液体稀释法进行试验，并根据试验结果作出分析。

二、结果与分析

1.细菌分离结果与分析。从病鸭心脏、肝和脑中分离出的可疑菌株，在巧克力琼脂平板上形成椭圆形、稍突出、水滴样、大小相近的菌落；麦康凯琼脂平板上的细菌不繁殖；在TSA平板上菌落平滑、潮湿、白色半透明，与鸭疫里莫氏杆菌的特征相同。

2.染色鉴定结果与分析。革兰氏染色呈紫色，单个存在，偶见几个排列呈弧形，细长杆菌，没有发现芽孢；不能运动；两极浓染的短小杆菌，与鸭疫里莫氏杆菌的染色特征相同。

3.生化试验结果与分析。结果表明，不发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、果糖、阿拉伯糖，硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、VP试验、甲基红试验、硫化氢产生、尿素分解阴性，氧化酶、触酶试验阳性（见表1）。试验证明该细菌为鸭疫里莫氏杆菌。

表1 分离菌生化鉴定结果

4.MIC值测定结果与分析。本试验选用多种药物，如阿米卡星、氨苄西林、环丙沙星等12种药物作为试验原料，对分离的12株细菌进行药物抗菌试验，结果见表2，从菌株耐药性角度分析：G4菌株对所有的药物具有很低的敏感性，其最小抑菌浓度均≥64克/毫升，具有很强的耐药性。相反G7、G8对所有药物都高度敏感，除氟苯尼考外，其最小抑菌浓度均＜0.0625微克/毫升。从药物的抗菌性角度分析：头孢曲松、亚胺培南和头孢吡肟这3种药物对G6、G7、G8、G9和G10五种菌株的最小抑菌浓度均＜0.0625微克/毫升，对其他菌株（G4除外），最小抑菌浓度分别为≤32、0.125和≤16微克/毫升，说明它们具有很好的抗菌性。环丙沙星、多西环素和庆大霉素这3种药物对G1～G12所有菌株（G4除外）的最小抑菌浓度分别为≤8、16和16微克/毫升，具有较好的抗菌性。上述其他药物对分离菌的最小抑菌浓度值有较大差异，可能与细菌个体差异有关。

表2 12种药物对12株鸭疫里莫氏杆菌的MIC测定结果（微克/毫升）

三、讨论

1.鸭疫里莫氏杆菌病的发展现状及原因。近年来，鸭疫里莫氏杆菌在菏泽市的发生十分复杂：首先是该细菌耐药性问题日趋严重。我国大多数养殖场使用大量抗生素来预防或治疗该病。这种行为不仅影响环境，还会造成细菌耐药性问题，本试验结果表明，分离的12株菌株中，G3和G4对阿莫西林和氨苄西林已经产生耐药性，为该病治疗和预防带来了很大难度。二是混合感染的发病率大大提高，给临床治疗带来很大难度，因此，必须重视和加强对鸭疫里莫氏杆菌感染的预防，加强宣传，引导养殖户科学养殖，避免耐药菌的出现和可能造成的环境污染问题，提高经济效益。

2.试验药物的作用效果。从病鸭肝、心脏和脑组织中分离得到的12株细菌，根据其病理变化、形态特征、染色结果、生化试验可以确定为鸭疫里莫氏杆菌。药敏试验结果表明，亚胺培南、环丙沙星的抗菌活性最高，它们对12株细菌的抑菌效果最好。庆大霉素、多环西素和头孢吡肟对鸭疫里莫氏杆菌也有较好的抗菌活性，除G4菌株外，它们对其他11种菌株的最小抑菌浓度均≤16微克/毫升。庆大霉素主要抑制细菌的蛋白质合成，从而发挥灭菌作用。多环西素通过改变细菌细胞膜的通透性，使细胞内核苷酸漏出，影响细菌DNA的复制，从而杀灭细菌。头孢吡肟主要通过抑制细菌细胞壁的合成而产生杀菌活性。因此，将3种药物作为备选药物使用。另外，革兰阴性菌在死亡后会产生大量的内毒素，对动物内脏产生严重的毒害作用，推荐在使用抗菌药物的过程中加入黄芪多糖。

3.预防措施。加强场区生物安全管理，入场人员需沐浴、换衣、采样，合格后方可入场。生产区与工作区分离，生产区进入工作区要沐浴换衣采样。进入鸭舍要脚踏火碱盆，工作期间用过硫酸氢钾消毒手部，过道使用5%氢氧化钠消毒，每日对鸭舍环境和异常鸭进行采样检测。及时清理病死鸭，用袋子密封，扔到指定区域集中处理。

四、结语