外泌体在肌腱损伤修复作用的研究进展△

杜佳哲，徐西林，薛玉满，张晓峰

（1.黑龙江中医药大学研究生院，黑龙江哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第三医院骨科，黑龙江哈尔滨 150016；3.黑龙江中医药大学附属第二医院康复科，黑龙江哈尔滨 150001；4.黑龙江省中医药管理局，黑龙江哈尔滨 150036）

肌腱损伤可分为急性肌腱损伤及慢性肌腱损伤，前者主要为肌腱断裂，后者主要为肌腱病。慢性肌腱损伤（肌腱病）是一种常见的肌肉组织疾病，自21世纪起其发病率在全球范围内不断上升，目前肌骨疾病的临床咨询约有30%涉及肌腱病，表现为肌腱及腱周组织的疼痛、肿胀和功能障碍［1］。肌腱损伤可见全身各处，常见部位包括跟腱、髌腱、肩袖在内，目前临床上常采用物理治疗、手术治疗的手段，但或多或少都面临治疗不彻底、易复发粘连、易再次受损等问题［2～4］。近年已有较多研究表明外泌体对于肌腱损伤的修复起到积极作用，但整体研究仍处于早期阶段，对于机制的研究不够清晰。本文将综述外泌体在肌腱损伤修复的研究进展，以挖掘其在该领域的潜力。

1 外泌体概述

外泌体是细胞外囊泡的类型之一，直径40～150 nm，多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体［5］。早期由于对功能认识不足，并未将其真正应用于再生医学领域。随着研究的深入，研究者逐步认识到外泌体具有特殊的“旁分泌”功能，可在细胞间扮演“信使”角色进行信息的传递和通讯，发挥调控细胞功能的作用，在组织修复领域具有极大的应用潜能［6，7］。

外泌体是通过细胞内囊泡及细胞膜的“内吞-融合-流出”过程分泌至外环境的，其中含有蛋白质、mRNA、miRNA 等生物活性物质［8］，亦可称之为“货物”，通过相关通路调节受体靶细胞的基因表达，翻译某些功能蛋白或沉默某些功能基因，继而起到影响细胞功能、改善疾病进程的作用［9］。不同来源的外泌体因其所搭载“货物”不同，递送至靶细胞后在肌腱修复中所起的作用也不一样。

2 不同来源的外泌体及其研究进展

2.1 干细胞来源外泌体

2.1.1 肌腱干细胞来源外泌体（tendon stem cell-de⁃rived exosome,TDSC-Exo）

肌腱干细胞（tendon stem cell,TDSC）作为多能干细胞具有一定的分化潜能，但相比其他供体来源细胞，其生成肌腱的潜力显然更大，且与肌腱损伤治疗的适配度更高。Zhang 等［10］认为促进TDSC 细胞迁移、增殖的过程可能与P13K/AKT 和MAPK/ERK1/2通路相关；该研究团队和另一团队还将目光集中于细胞外基质（extracellular matrix,ECM）上，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）、基质金属蛋白酶抑制剂 （matrix metalloproteinase inhibitor,TIMP） 比值的平衡最终促使肌腱愈合达到稳态［10，11］，前者认为ECM 的合成与MMP-9、TIMP-1相关，后者认为与MMP-3、TIMP-3 关系密切。此外，有研究者得出结论：上调血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor-A,VEGF A）的水平能促进TDSC-Exo 向肌腱细胞迁移，但在具体机制上还需进一步研究［12］。这一结果提示，生长因子参与影响外泌体作用于靶细胞的进程，并在一定程度上帮助肌腱细胞沉默了刺激作用。

2.1.2 脂肪干细胞来源外泌体（adipose stem cell-de⁃rived exosome,ADSC-Exo）

ADSC-Exo 相比其他具有更好的融合性，不仅因为脂肪干细胞相对更易从脂肪组织提取，也因为在体内广泛分布、具有较高的增殖率［14］。作为外泌体最重要的功能，其“旁分泌”功能也较其他来源更强。Liu 等［15］发现ADSC-Exo 能缓解早期炎症、可被TD⁃SC 吸收，在通过SMAD2/3、SMAD1/5/9 通路促进TDSC 成腱分化的同时，还能有效地促进成骨分化。Zhang 等［16］发现ADSC-Exo 能以抑制分解代谢、促进合成代谢的方式来阻止撕裂的肩袖肌腱发生退行性变。另有Finosh 等［17］考虑到模拟人体自然生理状态下的氧浓度，构建了缺氧（2%氧气浓度）的环境并与常规对照比较外泌体及腱细胞蛋白质水平和ECM修复/再生的关系。除关于信号通路及蛋白质的研究外，也有人将目标转向与巨噬细胞间的关系，认为在修复慢性肩袖损伤的过程中，M1 型极化被抑制、M2型极化得到增强，进而提出M1 和M2 的平衡，可能是治疗该疾病的新靶点［18］。总之，目前关于ADSCExo 的研究多集中于动物实验，面向临床应用仍存在多种问题：（1）现有实验样本量来源较小、试验周期较短；（2）未找到最适合ADSC-Exo 的治疗肌腱损伤的浓度等，还需进一步研究。

2.1.3 骨髓间充质干细胞来源外泌体（bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosome,BMSC-Exo）

在很长一段时间，骨髓及骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）作为无细胞疗法所涉及的外泌体来源在肌骨疾病的基础研究、临床治疗上扮演了重要角色［19，20］。由于其具备了更好的成骨、成软骨潜力，所以在本领域中的研究和促进“腱骨愈合”契合度更高。Li 等［21］发现BMSCExo 能通过miR-23a-3p 促进巨噬细胞由M1 型向M2型极化，促进腱骨愈合；Shi 等［22］发现BMSC-Exo在水凝胶的结合下也能促进巨噬细胞极化、促进细胞增殖，且尤以CD146+的变化最为明显；同样是水凝胶结合的条件，Zhang 等［23］在加入2%氧浓度的条件后，认为相比常氧条件下促进血管化、骨形成和重塑的能力更强，且更利于在移植处缓慢释放。Yu 等［24］在证实BMSC-Exo 具有促进肌腱干/祖细胞增殖、迁移、成腱分化能力后，还通过将其嵌入纤维蛋白凝胶，有控制地、缓慢地作用于损伤区域。不难发现，作为目前应用相对广泛的干细胞，对BMSC-Exo 的研究深度远超其他，且多与组织工程中的各种细胞支架相结合，该研究路径能够给其他干细胞的研究提供一些思路。

2.1.4 脐带间充质干细胞来源外泌体（human umbili⁃cal cord mesenchymal stem cell,hUCMSC-Exo）

hUCMSC-Exo 来源于人的脐带，在成本、泛用性等方面具有不错的前景。姚之肖［26］用特异性miR⁃NA-miR-29a-3p 的激动剂和拮抗剂分别修饰hUC⁃MSC-Exo，使得促肌腱愈合、抗纤维化的作用均得到提升，同时他还将抗肿瘤药物HCPT 的抗纤维化特性引入肌腱粘连领域，为药物预处理外泌体提供了思路。此外，Han 等［27］发现miR-27b-3p 修饰的hUC⁃MSC-Exo 能抑制RhoA 的负调节因子ARHGAP5 表达，进而导致RhoA 激活、细胞增殖。总体而言，目前关于hUCMSC-Exo 在肌腱损伤的研究尚少，大多都和特定miRNA 修饰、工程化改造相关，用于探究减少肌腱粘连、促进愈合的信号通路和发生机制，未来整体发展前景较好。同时也要看到，抗纤维化药物的创新性引入为该领域带来了新的活力。

表1 四种干细胞来源外泌体对肌腱修复的作用Table 1 Comparison of four stem-cell derived exosomes in tendon repair

2.2 巨噬细胞来源外泌体

在非干细胞来源的外泌体研究中，炎症过程中的重要细胞—巨噬细胞引起了研究人员的注意。崔昊旻［28］发现，在肌腱粘连发生时，巨噬细胞扮演“调控者”的角色，而肌腱细胞和成纤维细胞作为“制造者”受到巨噬细胞来源外泌体调控，其中含量最高的miRNA-21-5p 使靶基因SMAD7 表达增强，通过激活TGF-β1/SMAD 通路使粘连发生。Yu 等［29］研究得出结论，M2 巨噬细胞来源外泌体通过cir⁃cRNA-Ep400 的传递，能抑制其下游目标—miRNA-15b-5p 的表达，但同时也加强了FGF1/7/9 在肌腱细胞和成纤维细胞的表达。总结这两个实验结果，可得出结论：外泌体参与并介导了巨噬细胞与肌腱细胞/成纤维细胞的通讯，通过改变miRNA 的表达以实现增殖的目的，未来可将此方法用于靶向治疗肌腱粘连。

2.3 血小板来源外泌体

Lu 等［30］通过将一种特定的转录因子-Yap1 负载于血小板来源的外泌体上，以促进肌腱干/祖细胞活性、提高成腱分化潜力，并最终与ECM 结构的甲基丙烯酸明胶支架结合，用于修复畸形肌腱缺损。由于富血小板血浆本身富集大量生长因子、趋化因子，以其作为来源在促进肌腱修复的同时还可以抑制炎症因子分泌、促进ECM 合成。但总体而言，与广泛应用于膝骨关节炎、软骨组织修复不同，血小板来源外泌体在肌腱病的研究鲜有报道，未来亟待填补空白。

2.4 肌腱细胞来源外泌体

肌腱细胞是构成肌腱的重要细胞，由于受限于本身的增殖能力、数量，使得肌腱发生急慢性损伤后恢复较差，所以通常需要具有更强的增殖、分化能力的间充质干细胞的介入。Xu 等［31］富有创新性地提出了肌腱细胞来源的外泌体可以通过TGF-β 介导，来诱导BMSC 的定向成腱分化，以形成大量的肌腱细胞达到治疗目的。

3 组织工程和临床创新转化

经过大量基础实验，关于外泌体修复肌腱损伤发生机制和信号通路的研究取得了一定进展，外泌体和组织工程结合也更加紧密，并在相当程度上促进了临床创新转化和成果产生［32，33］。

3.1 新型生物外泌体贴片

组织工程有3 个主要因素，即“种子细胞”“生长因子”和“支架材料”［34］，在前两者相对确定的前提下，如何运用材料学创新搭建新型的生物支架成为主要研究方向，当前不乏有研究将水凝胶支架与外泌体共同应用［35，36］。近期有研究人员选取了贴片与外泌体结合的形式。Shi 等［37］选用人类供体血浆来源的外泌体PEP 以及Tisseel 贴片对狗的屈肌腱模型进行实验，得出结论：在改善生物力学特性的同时，可加速成纤维细胞向损伤部位间隙迁移并减轻炎症；Zhang 等［38］在兔肩袖撕裂实验中，将BMSC-Exo 装载至水性聚氨酯肩袖贴片上构成新型贴片，同样证明了能改善组织学、生物力学特性，促进肌腱修复。

3.2 氧化铁纳米粒子修饰下的外泌体

Wu 等［39］则在研究BMSCs 促进腱骨愈合的基础上，在磁场条件下加入了氧化铁纳米粒子构成新型外泌体，富集的miR-21-5p 下调SMAD7 表达的同时激活TGF-β/SMAD 通路，有效阻止骨道周围的骨丢失，促进纤维化。相比传统方法，其为外泌体运动提供了驱动力，同时又通过磁疗起到了调节炎症的效果。

3.3 一氧化氮纳米马达驱动的外泌体

与物理纳米马达及无法进入细胞内部的微米级的生物马达相比，Liu 等［40］开发出了由一氧化氮纳米马达修饰的外泌体，搭配可拆卸的微针，在大鼠的跟腱模型实验中起到了调节抗炎因子/促炎因子表达、加快愈合、促进再生的效果。微针在病变局部透皮减少了药物注射带来的损耗，又利用一氧化氮构建了自驱动的化学纳米马达，通过排出气泡移动将药物传递至指定部位，且产生的气体还能加强渗透深度。

4 展 望

在肌腱损伤的治疗上，尽管当下包括外泌体在内新兴的“无细胞疗法”发展迅速，但手术及物理治疗仍是主流。一方面受限于干细胞等供体细胞的来源，在提取、培养上较繁琐，另一方面目前研究仍多停留于基础研究及体外实验阶段，距离大规模应用于临床还有很长的路要走。在基础领域，外泌体与组织工程的进一步结合是必然，理想化的组织工程技术接近于完全修复肌腱组织而无需考虑后续的粘连问题，最大限度恢复肌腱的原有功能，但鉴于目前该技术仍处于初级阶段，还需更多成果来支撑。以“三大因素”为例：“种子细胞”—即外泌体来源，未来应寻找更多的肌腱特异性标志物，并以此为基础指导纯化、修饰、编码外泌体；“支架材料”—如何在纳米层面运用现有高新技术（如3D 打印等）构建新型生物支架，在满足生物力学的同时，使得外泌体间的“旁分泌”通讯能在人为干预下更加有控制、缓慢地完成；“生长因子”—目前还鲜有研究将生长因子及外泌体相结合共同进行探讨，在各自对于肌腱修复研究日益拓宽的当下，二者结合有利于形成更加高效的治疗方案。此外，研究人员还应致力于扩大寻找新的分子靶点、研制靶向药物，并进一步研究靶向药物介入对外泌体的影响，寻求更好的临床疗效。