青蒿素及其衍生物对烧伤后肝脏损伤的保护作用机制

李齐齐，江 铭，邱 玲，胡 伟，胡克甦

（1 南通大学医学院，江苏 226001；2 南通大学附属医院烧伤整形科）

根据世界卫生组织统计,全球每年烧伤患者约1 100 万人,其中重度烧伤导致死亡约30 万人[1]。大面积烧伤引起的休克、败血症、全身多器官功能衰竭等严重并发症是造成烧伤患者死亡的主要原因。严重烧伤时,一方面肝脏产生内质网应激,导致肝细胞凋亡,另一方面由于烧伤创面感染发生脓毒血症,从而引发多脏器功能衰竭。肝脏一旦遭受实质性损害,不仅影响物质代谢、解毒、蛋白质合成等功能,而且影响抗生素效果。因此,保护肝脏是救治严重烧伤患者的重要环节。铁死亡（Ferroptosis）是近年发现的一种细胞死亡方式,在炎症中具有重要作用,几种具有铁死亡抑制作用的抗氧化剂表现出抗炎作用[2]。

青蒿素（Artemisinin,ART）是青蒿的主要有效成分,杀死疟原虫的主要机制涉及抑制Fe2+介导的自由基产生,增强对疟原虫DNA 损伤、线粒体去极化和细胞死亡作用,还涉及干扰肌浆/内质网钙ATP 酶及线粒体电子传递链、影响免疫系统功能以及抑制血管生成[3]。此外,ART 在炎症、免疫调节、血管生成和内质网应激中发挥作用,其抗炎及免疫调节作用已应用于肝脏疾病相关领域。

1 青蒿素通过AMPK/NF-κB/NLRP3 通路抑制炎症反应

腺苷50-磷酸-活化蛋白激酶（adenosine-5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK）是一种十分保守的调节剂,主要负责感知营养和控制能量平衡[4],参与调节炎症反应[5]。B 细胞中核因子κ-B（nuclear factor κB,NF-κB）是Rel 家族重要的转录因子,广泛分布于各种细胞中[6],参与细胞增殖、炎症及获得性免疫等多种重要生命活动。NF-κB 转录因子形成多种同源或异源二聚体:NF-κB1（p50）、NFκB2（p52）、RelA（p65）、RelB 和c-Rel。NF-κB1 在机体非激活状态下与RelA 发生相互作用,而在机体激活状态下,p50 在胞浆内处于静息状态[7]。在经典NF-κB1 信号通路刺激下,抑制性IκB α 蛋白被26S蛋白酶体磷酸化和降解,从而释放活性转录因子异二聚体p50-RelA,进入细胞核调节靶基因的表达。NF-κB 在感染引起的炎性反应中被激活,在炎症因子活化的情况下,AMPK 对NF-κB 具有明显的抑制作用,并且NF-κB 信号通路与促炎细胞因子异常释放密切相关[7]。通过转录一些细胞因子来介导免疫应答反应,清除入侵病原菌。严重烧伤后NF-κB 活化导致IL-6、TNF-α 和IL-1β 等炎性因子分泌。

在过度炎症状态下,多种免疫细胞受到病原菌相关分子（pathogen-associated molecular pattern,PAMPs）和损伤相关分子（damage associated molecular patterns,DAMPs）的活化,释放大量促炎因子[8]。NLRP3 炎性小体作为固有免疫的重要组分,通过识别PAMPs 引发炎性反应。NLRP3 炎性小体可感知外源性和内源性各种危险信号,在静息状态下各类炎症因子表达量水平极低,无法装配或激活NLRP3 炎性小体。在被激活后NLRP3 炎性小体招募并激活procaspase 1,进而将IL-1β 的前体裂解激活[9]。研究显示,NLRP3 水平随着人类烧伤严重程度的增加而增加,NF-κB 信号通路活化对NLRP3 炎性小体的激活是必要的[9]。

有研究显示,青蒿素干预可有效抑制NLRP3 炎性小体相关蛋白表达,促进AMPK 磷酸化,抑制NF-κB 和NLRP3 炎性小体的活化,从而导致下游炎症细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）分泌减少[10]。青蒿素可以上调AMPK 表达,也可下调NF-κB p65 的活性,通过影响AMPK/NF-κB/NLRP3 炎性小体相关信号通路而发挥抗炎作用[11]。

2 青蒿素通过抑制内质网应激保护肝脏

内质网为膜状网络结构,发挥整合细胞信号和平衡内环境作用。内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）是指内质网中异常折叠蛋白聚集,引起细胞内Ca2+稳态失衡、去折叠蛋白反应、内质网过载等一系列反应。内质网应激激活细胞内应激通路,在脂质蓄积、胰岛素抵抗、炎症及随后肝细胞死亡中发挥重要的病理生理作用。肝脏蛋白合成和糖脂平衡的维持中具有重要作用,特别容易受内质网应激的影响[12]。长期内质网应激超出细胞的代偿能力,导致细胞凋亡。

YU 等[13]研究表明,青蒿素可抑制IL-6 释放,双氢青蒿素可显著抑制小鼠RAW264.7 巨噬细胞IL-6、TNF-α 和一氧化氮释放,并具有良好的剂量依赖性。双氢青蒿素通过下调一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）表达,抑制巨噬细胞炎性因子及一氧化氮分泌而发挥作用[14]。此外,青蒿素可抑制缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α）的激活。炎症刺激发生在细胞感染过程的早期,与细胞氧化还原、MAPK 信号激活和内质网应激的变化有关[15]。炎症激活与内质网应激密切相关。内质网稳态的失调会引起未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）,持续UPR 是肝脏炎症发生和发展的重要原因。在感染早期NF-κB 的激活与MAPK 信号和UPR 诱导剂IRE-1α 的表达增加相关[16]。UPR、MAPKs 及NF-κB 蛋白相互作用,但具体机制有待进一步研究。青蒿素不仅在减轻炎症方面具有优势,还可能通过抑制内质网应激作用保护肝脏。

3 青蒿素通过调节铁死亡相关信号通路减轻肝纤维化

铁死亡是由铁超载、脂质过氧化及细胞膜破坏等多种因素引起的细胞程序性坏死。铁是机体必需元素,但铁过载会导致细胞铁死亡。理论上,通过干预铁代谢任何环节（吸收、储存、利用和流出）增加细胞内铁浓度可以诱导细胞发生铁死亡。研究发现越来越多生理和病理生理过程涉及细胞铁死亡及免疫反应失调,药物或环境应激（如缺血再灌注损伤、昼夜节律钟紊乱）引起的组织损伤均可引发细胞铁死亡[3]。失调的细胞死亡机制以及异常的宿主反应是多种病理过程的特征,包括癌症和炎症相关疾病。过量的铁积累和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）的抑制是触发铁死亡的两个关键初始信号。晚期糖基化终末产物受体（advanced glycosylation end product specific receptor,AGER）是免疫球蛋白超家族成员,可通过与多种损伤相关分子模式（danger associated molecular patterns,DAMPs）（如HMGB1、S100 等）结合激活多种信号途径,如蛋白激酶C、JAK 信号转导因子、转录激活因子（STAT）途径酪氨酸磷酸化、MAPK/NF-κB 等[17]。AGER 信号与急性或慢性炎性疾病有关,如脓毒症、胰腺炎和糖尿病。AGER 中和抗体或小发夹RNA（shRNA）研究证明AGER 在介导嗜铁细胞启动的炎症和免疫反应中的关键作用[3]。DAMPs 是一类类似于感染性细菌蛋白,通过与模式识别受体（pattern recognition receptor,PRRs）作用,活化下游转录因子如NF-κB、IRF 等,从而诱导多种免疫反应[3]。细胞凋亡与铁死亡是免疫原性的,随着受影响的细胞释放DAMPs 和报警蛋白,机体将产生一系列免疫原性相互作用,最终会放大细胞死亡并促进一系列与炎症相关的反应[3]。

最新研究报道细胞铁死亡可能在肝纤维化中发挥重要作用。CARLSON 等[18]研究阐明铁死亡调节因子GPX4 对肝细胞存活和正常肝功能的重要性。肝脏调节代谢的能力由转录调节网络控制,关键调节因子包括孤儿核受体成员,其中最重要的是过氧化物酶体增殖物激活受体α（recombinant peroxisome proliferator activated receptor alpha,PPARα）、法尼类X 受体（Farnesoid X receptor,FXR）和肝X 受体（liver X receptor,LXR）[19]。这些受体都参与脂质稳态的基因转录,从而调节肝脏和全身的能量代谢。双氢青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）通过FXR 激活依赖机制限制肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSC）接触,从而减轻肝纤维化[20]。DU 等[21]阐明信号分子（Hedgehog,Hh）和转录共激活因子相关蛋白（tran scription coactivator related protein,YAP）抑制剂降低HSC 活性,并抑制组织器官尤其肝脏中的成肌纤维细胞活性。YANG 等[22]证实,血红素加氧酶1（heme oxygenase,HO1）通过调节NF-κB 通路促进HSC 凋亡,保护肝脏免受纤维化。青蒿琥酯是一种可溶于水的青蒿素类化合物,具有抗炎、抗肿瘤和免疫调节等多种药理活性,是潜在的铁死亡诱导剂。OOKO 等[23]已证明,青蒿素类化合物能引起肿瘤细胞铁死亡。LIN 等[24]研究表明,青蒿素类化合物可特异性诱导肿瘤细胞凋亡[3],阻断Nrf2-ARE 信号通路可增强耐药细胞对铁死亡的易感性。青蒿琥酯通过调节铁垂病信号通路来减轻肝纤维化。

青蒿琥酯与铁死亡标志分子GPX4、前列腺素过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2,Ptgs2）、纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白（alpha sarco meric actin,α-SMA）共定位,机体释放大量Fe2+,脂质过氧化,致使机体抗氧化能力降低。去铁胺（deferoxamine,DFO）可以逆转青蒿琥酯对肝脏的抗纤维化作用[20]。青蒿琥酯诱导的活化肝星状细胞核变性是其抗纤维化作用所必需的。青蒿琥酯可激活HSC 铁转运,此作用与激活铁蛋白的吞噬有关。

综上所述,大面积烧伤患者会反复出现急性和长期肝功能异常。大量研究显示,青蒿素及其衍生物具有抑制炎症反应、保护肝脏及减轻肝纤维化等作用,有望成为烧伤临床可供选择的药物,有利于改善烧伤患者的长期预后。