KLF4与肺部相关疾病研究进展

武倩男 张璐璐 邢雁青 霍如婕 田新瑞

Krüppel 样因子 4 (Kruppel-like factor 4,KLF4),也称为肠道富集的Krüppel样因子(Gut-enriched kruppel-like factor,GKLF),是最早发现的 KLF 家族成员之一。它是一种高度保守的含锌指转录因子,可在人体多种组织中表达,调节细胞生长、增殖、分化、凋亡等多种过程[1],同时它是一种双功能转录因子,对于不同的靶基因能够通过不同的机制激活或抑制转录[2]。KLF4含有483 个氨基酸,分子量为 53 kDa,其特征在于羧基末端序列中含有三个锌指基序。而在氨基末端,拥有一个反式激活结构域,与其相邻的则是一个抑制结构域,这些特性决定了KLF4可通过与其他因子相互作用和调节 DNA 结合效率从而影响转录调节活性的特异性。作为一种多功能转录因子,可通过磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化调节在多个水平上进行参与调节细胞的转录、翻译过程[3],因而可在不同的疾病中发挥不同作用。近年来,对KLF4在呼吸系统疾病中的研究有了深入发展。现就KLF4在呼吸系统疾病中的作用综述如下。

一、KLF4与支气管哮喘

哮喘是一种以气道慢性炎症为特征的呼吸道疾病[4]。关于哮喘的诊断及治疗方案虽不断改进,但在哮喘的发病机制上所取得的研究成果仍十分有限。多项研究发现在哮喘及其他过敏性疾病患者中,KLF4的表达水平均较健康患者明显升高,这意味着KLF4可能在哮喘等过敏性疾病中发挥着关键作用。最新的研究发现,KLF4可能通过OX40L、胸腺基质淋巴细胞生成素(transactions on speech and sanguage processing,TSLP)及肺泡巨噬细胞(alveolarmacrophage,AAM)等不同途径在哮喘中发挥重要作用。

OX40L也称为 CD252,最初称为糖蛋白34 kDa (GP34),与其同源受体OX40,均属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)和TNF受体超家族。OX40L主要由抗原呈递细胞表达,包括活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞以及内皮细胞。在小鼠和非人灵长类动物哮喘模型中发现,抑制OX40L会减少TSLP表达。TSLP可介导Th2型炎症,当其在肺中过表达时可导致严重的气道炎症和气道高反应性(airway hyper reactivity,AHR)[5-6]。最新有研究发现,在哮喘小鼠模型中,当KLF4过表达时,OX40L基因的启动子活性明显降低,而当KLF4表达减少时,OX40L基因的启动子活性则明显增强,其通过实验证明KLF4对OX40L具有明显的抑制作用[7],该团队研究发现通过KLF4过表达沉默OX40L启动子来抑制气道炎症及高反应性缓解哮喘的发生、发展。而Jeanette及其团队则证实在敲除KLF4基因的哮喘小鼠模型中,TSLP生成明显减少,这意味着KLF4或许可直接作用于TSLP,该研究团队的实验结果则证明KLF4在急性哮喘小鼠模型中可促进气道炎症和重塑[8]。上述不同实验研究表明KLF4通过OX40L、TSLP在哮喘中发挥的作用较为复杂,其兼顾促炎及抑炎作用,通过靶向KLF4-OX40L-TSLP轴平衡哮喘气道炎症及高反应性,或可为研究哮喘发病机制或治疗哮喘的发生与发展提供新的研究方向及思路。

Yong Gyu Lee发现哮喘小鼠模型中的肺泡巨噬细胞(alveolarmacrophage,AAM)可在Th2介导的免疫微环境中分化并极化为M2型(促哮喘炎症表型),其表现出吞噬作用降低和自身免疫受损,该过程可诱导气道炎症加重和肺部嗜酸性粒细胞募集,加重哮喘的进展[9]。KLF4可诱导单核细胞趋化蛋白诱导蛋白(monocyte chemoattractant protein-inducible protein,MCPIP)的RNase和去泛素酶活性,从而刺激活性氧的产生,进而导致AAM向M2型细胞极化,此外也可通过抑制NF-κB 通路来抑制M1极化,进一步促使AAM向M2型分化。另一方面,KLF4可刺激过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptors,PPAR-γ),诱导细胞有氧呼吸,这是 M2 细胞分化所必需的。KLF4可通过上述不同途径上调M2极化并抑制M1极化,诱导AAM分化为M2型巨噬细胞[10]。Song等人通过使用大黄素下调小鼠哮喘模型中KLF4,降低AAM极化为M2型巨噬细胞,从而缓解哮喘小鼠气道炎症及重塑,再次证实KLF4可通过AAM影响哮喘的发生及发展[11]。

关于KLF4在哮喘中发挥的具体机制似乎很复杂。既往研究中,无论是实验哮喘小鼠模型亦或者是哮喘及过敏性鼻炎等过敏性疾病患者中,KLF4表达水平均可见明显升高,且通过降低KLF4表达水平,气道炎症及重塑均较前明显缓解。不同的是最近则有学者发现KLF4亦可通过OX40L轴抑制炎症而缓解哮喘发展。这或许与KLF4的双功能转录相关,我们十分期待未来关于KLF4在哮喘中的进一步研究,这或许可进一步揭示哮喘新发病机制,并可能为该疾病的治疗提供新的思路或靶点。

二、KLF4与肺癌

肺癌是全世界最致命的疾病之一。在美国,肺癌的五年生存率为 17.7%,而我国的肺癌患者仅为 16.1%,其已成为我国医疗的严重负担[12]。其根据病理类型的差异,可分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。目前与KLF4研究相关性较高的为NSCLC。病灶转移被认为是NSCLC患者治疗失败及死亡的最主要原因之一。上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)被认为是病灶转移的关键因素[13]。近来研究发现KLF4可通过雷帕霉素的机制靶点(Mechanistic targets of rapamycin,mTOR)途径影响NSCLC的转移。

mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,属于 PI3K 相关激酶家族,mTOR 通过两种结构和功能不同的多蛋白复合物—— mTOR 复合物 1和 mTOR 复合物 2在细胞生理学中发挥作用,而雷帕霉素不敏感伴侣(Rapamycin-insensitive companion of mTOR,Rictor)属于mTORC2[14]。Huiling Zhou等人通过 RNA 干扰沉默了 NSCLC 细胞的 Rictor 表达,结果显示 NSCLC细胞的迁移能力显著下降。在实验中发现,NSCLC细胞中的间充质标志物波形蛋白和 E-钙粘蛋白转录抑制因子 Slug 表达明显下降,上皮标记物 E-钙粘蛋白和 β-连环蛋白的表达则增加。这些结果表明抑制 Rictor可导致反向间充质-上皮转化(Mesenchymal-epithelialtransition,MET)——这是 EMT 的逆过程,进而降低癌细胞的运动性、侵袭性,并参与EMT 重编程的调节。而将NSCLC 中KLF4 敲低后Rictor 的表达下调,同时伴随波形蛋白和Slug 表达的减少。Rictor还可与mTOR组成复合物,且该复合物参与EMT的重编程[15],敲低KLF4后该复合物明显减少,证明KLF4影响 Rictor的表达。KLF4 的敲低导致 Rictor 及其复合物的下调,伴随着 MET 的一系列特征性变化,显著降低了 NSCLC 细胞的迁移、侵袭和转移。通过靶向KLF4降低 Rictor表达,抑制NSCLC的转移,或可能是未来用于治疗NSCLC的一种策略[13]。

肿瘤相关巨噬细胞 (Tumor-associated macrophage,TAM) 是肿瘤微环境的重要组成部分[16],其通过影响肺癌发生的过程,包括肺癌细胞的增殖、侵袭和转移被认为是肺癌进展的关键因素。TAM可分化为 M1型(经典激活)和 M2型(交替激活),因此同时具有抗肿瘤和促肿瘤作用[17]。M1 型巨噬细胞的功能是促进Th1反应包括杀微生物和杀肿瘤作用[17-18]。M2 型巨噬细胞的功能是诱导 Th2 反应并促进组织修复和重塑、血管生成和免疫抑制,以及肿瘤进展[16]。相关临床数据表明,约70 % 的 TAM 为 M2 型,其余为 M1型,这意味TAM在促癌方面可能更占据优势[19]。上文提及,KLF4可通过不同途径上调M2极化,抑制M1极化。通过靶向抑制KLF4表达,减弱M2型巨噬细胞激活,或可能成为一种治疗肺癌的新型方案。

三、KLF4与肺炎

肺炎链球菌是社区获得性肺炎最常见的致病病原体,目前多重耐药肺炎链球菌菌株的出现增加了与肺炎球菌肺炎相关的发病率和死亡率[20]。肺的先天免疫系统是消除侵入性肺炎球菌的关键,多形核中性粒细胞 (Polymorphonuclear neutrophil,PMN) 和巨噬细胞是肺先天免疫反应细胞中的重要效应物。这两种细胞均由骨髓中的骨髓前体形成,在血液中以静止的PMN或单核细胞的形式循环,在肺相关部位发生炎症时被招募,转化为活化的效应细胞[21]。在识别细菌成分后,活化的PMN和巨噬细胞会通过各种机制例如吞噬作用、抗菌化合物的释放、跨越细胞外陷阱等消除病原体如肺炎球菌,并通过产生细胞因子和抗原呈递至细菌的效应细胞来协调免疫反应。另一方面PMN活化后其 NADPH 氧化酶复合物会释放细胞外活性氧 (Reactive oxygen species,ROS),其对病原体的灭解亦发挥重要作用[22]。

Shen Yuyan等人研究发现KLF4 是PMN的关键转录调节因子。其使用脂多糖或大肠杆菌刺激特异性KLF4敲除的小鼠骨髓PMN,通过定量实时 PCR测定实验组小鼠中性粒细胞中的基质金属蛋白酶9(Matrix metallopeptidase 9,MMP-9)即中性粒细胞特征性细胞器水平,发现其较对照组明显降低,证实KLF4在诱导PMN生长中起关键作用,但具体通路仍需进一步探讨[23]。Shen Yuyan等人通过肺炎小鼠模型证实缺乏KLF4的PMN所产生的ROS较正常PMN明显减少,且标志细胞凋亡的caspase-3 的激活显著减弱,表明细胞凋亡受到干扰。与正常中性粒细胞比较,缺乏 KLF4 的中性粒细胞不能有效杀死细菌。这些数据表明 KLF4 是中性粒细胞炎症反应所必需的[23]。通过上述论述,缺乏KLF4后PMN对病原体的消除能力明显下降,从而导致炎症进一步加重,表明 KLF4 可能是治疗肺炎等中性粒细胞介导疾病的可行靶点。

四、KLF4与肺动脉高压

肺动脉高压(pulmonary hypertension,PAH)是一种以肺血管阻力和肺动脉压升高为特征的呼吸系统疾病[24],其特征是肺动脉平滑肌细胞(pulmonary-artery smooth muscle cells,PASMCs)过度增殖,导致血管重塑失调。

香烟烟雾(cigarette smoke,CS) 是已知的肺动脉高压危险因素,其可诱导PASMCs 过度增殖和细胞外基质过度沉积导致的动脉壁增厚直接导致肺小血管重塑[25]。Sun等人研究发现KLF4可通过抑制AKT通路的激活发挥正向作用,从而抑制细胞增殖,使血管形态接近正常[26]。其研究团队通过气管内给药(AAV1-KLF4-shRNA)敲低CS-PAH大鼠模型 KLF4 基因后发现随着实验组大鼠肺血管中KLF4表达的降低,PASMCs过度增殖及小血管壁增厚较对照组均有明显改善,右心室血流动力学指数也较对照组明显下降。其实验证明通过气管内给药AAV1-KLF4-shRNA 敲低 KLF4 基因,可抑制肺血管重塑和改善右心室血流动力学,对 CS 诱导的PAH大鼠模型具有体内预防和治疗作用。基于此,通过气管内滴注从而敲除或抑制肺血管内KLF4基因在未来或许可成为PAH的预防及治疗方式[27]。

五、KLF4与特发性肺纤维化

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)的发生与疾病早期气道上皮细胞(airway epithelial cell,AECs)长期反复损伤和异常修复有关,它被认为是一种端粒介导的疾病[28]。Dai等人研究表明,具有端粒酶逆转录酶(Telomerose reverse transcriptas,TERT)突变的 IPF 患者通常伴有较短的端粒,且绝大多数患者端粒酶活性降低,端粒长度缩短,Cox比例风险模型分析也表明外周血有核细胞端粒长度缩短是 IPF 患者生存的独立危险因素[29]。Povedano等人通过实验发现上皮细胞中的 TERT 表达能够抵抗博来霉素诱导肺纤维化,TERT 的缺乏会影响上皮细胞的增殖,并可能导致上皮再生受损使肺纤维化增强[30],这些研究表明端粒缩短在IPF的发生发展和预后中具有重要作用,是IPF发生的重要分子基础。最新的研究发现,KLF4可能通过调节肺纤维化的肺泡上皮细胞中TERT的转录而参与肺纤维化的发病机制[31]。

Hoffmeyer等人报道称,KLF4 在端粒酶基因表达调控中起重要作用。人类胚胎干细胞中 KLF4 的消耗可导致TERT蛋白的表达降低。在hESCs中,β-catenin与KLF4结合形成复合物,与TERT基因的启动子区结合,调节TERT基因的表达,促进端粒延长[32]。在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中衰老标志物P16、P21和P53的表达显著升高,KLF4及TERT表达均减少。通过构建腺相关病毒-6载体介导KLF4过表达的SP-C启动子,特异性靶向AECs,提高KLF4在肺纤维化中的表达水平,端粒酶活性也随之上调,端粒长度也较对照组长,表明KLF4可以保护肺纤维化的端粒活性及长度。当KLF4表达下调时,TERT启动子转录也随之减少,端粒酶活性下调。证明KLF4可能是通过与TERT启动子结合,诱导TERT表达和保护端粒酶活性[31]。该研究表明KLF4可能是进一步了解肺纤维化机制和开发治疗肺纤维化新策略的有希望的潜在靶点。

已有研究证明,在IPF进展期间,M2型巨噬细胞在肺巨噬细胞分化中占据主要优势[33],其是促进IPF进展的因素之一[34]。M2型巨噬细胞可分泌多种生长因子,包括转化生长因子-β (Transforming growth factor-β,TGF-β)、纤维母细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)、血小板源性生长因子-α (Platelet-derived growth factor α,PDGF-α)、胰岛素样生长因子 1 (Insulin-like growth factor 1,IGF-1) 和血管内皮生长因子 (Vascular endothelial growth factor,VEGF)[35]。TGF-β是IPF的关键促纤维化因子,可诱导EMT的发生,这是肺泡上皮细胞向肌成纤维细胞转化的关键过程[36]。FGF、PDGF-α、IGF-1、VEGF这些细胞因子的刺激可增强成纤维细胞的增殖,并增加肌成纤维细胞的诱导分化。肌成纤维细胞的快速增殖、胶原蛋白和纤连蛋白等细胞外基质蛋白的过度沉积以及高收缩能力进一步导致纤维化发展[35]。综上所述,KLF4通过调节肺泡上皮细胞中TERT的转录及巨噬细胞的分化,可在IPF中发挥重要作用。

六、KLF4和急性呼吸窘迫综合征

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),是一种破坏性呼吸系统综合征,在全球范围内均具有较高的死亡率[37]。其临床特征包括严重的低氧血症、双肺炎性浸润、肺水肿、肺顺应性下降和功能残气量下降[38]。病理变化主要为肺泡-毛细血管膜功能障碍进而导致血管通透性增加,使大量含有蛋白质的液体渗出、肺泡出血和纤维蛋白沉积[39]。越来越多的证据表明巨噬细胞是ARDS 发病机制中的关键因素。而Saleh、Mohd等多人均发现通过靶向诱导KLF4表达可调节肺巨噬细胞在ARDS中发挥重要作用[40-41]。在最初 ARDS 中受到刺激后,AAM 会立即转变为M1表型,释放各种有效的促炎介质,包括 IL-1β、IL-6 和 IL-18,帮助中性粒细胞穿过内皮和上皮,进入肺和肺泡空间发挥作用[42]。因此,M1 型巨噬细胞在ARDS 肺组织损伤过程中起促进作用。消除致病因素后,驻留和募集的巨噬细胞从 M1表型转变为抗炎 M2表型。它们产生抗炎细胞因子,例如 IL-10 和 IL-1 受体拮抗剂,以响应Th2细胞因子[43]。此外M2 巨噬细胞具有强大的吞噬能力,可清除坏死细胞和碎片,吞噬细胞,消除凋亡细胞,激活抗炎信号并终止促炎反应[44]。晚期时M2巨噬细胞在肺组织修复中发挥重要作用,其过度的激活会导致肺部的纤维化反应,如上文IPF中所述。因此,通过靶向KLF4调节巨噬细胞极化来减少早期过度的促炎反应和晚期过度的成纤维细胞增殖可能是 ALI/ARDS 可行的治疗思路。

七、总结与展望

KLF4可在细胞发育、重编程等过程发挥重要作用。它最初被认为是细胞生长的负调节剂,能够调节参与细胞周期进程的许多基因的表达。本文综述了KLF4在呼吸系统疾病中有可能的作用机制及途径,我们仍需认识到,KLF4是一种双功能转录因子,在不同的细胞环境及细胞类型中可能会起到完全相反的作用。随着对KLF4越来越多的研究,其更具体的机制及靶点将进一步明确,未来通过靶向KLF4对于呼吸系统疾病的预防及治疗或成为一种可行的方案。