基于药物研发的药学综合实验设计

韩金娥，周 莹，蒋 敏，钱建瑛，高越颖，李 会

（江南大学生命科学与健康工程学院，江苏无锡 214122）

0 引 言

为主动应对新一轮科技革命和产业变革，实现国家产业转型升级，教育部积极推动“新工科”建设、“双一流”建设，要求高校打破传统学科之间的壁垒，推进学科交叉与跨界融合，以培养适应国家战略需求的高素质、应用型和复合型的创新人才［1-3］。实验实践教学作为高校人才培养的关键载体，是高水平人才培养不可或缺的重要支撑，在新时代人才培养模式改革中，实验实践教学无疑是重要的突破口和切入点。

制药工艺综合实验是我院专业课程体系的重要组成部分，是培养学生实验技能，巩固理论知识及提高学生综合素质的重要环节。然而，该课程仍存在设计性、研究型实验比例偏低；实验内容缺乏系统性和整体性，各学科“各自为政”，缺乏交叉渗透、相互融合等缺点，无法满足“新工科”的理念，即强调学科的实用性、交叉性与综合性［4］。由此，实验教学团队对该课程的实验项目进行了改革，注重各学科在逻辑和结构上的联系与组合，加强实验内容的综合化、一体化及多学科知识的交叉融合，将药物化学、药物分析、药理学和药物制剂四大主干课程知识进行衔接和交叉融合，形成连贯性、一体化的实验教学体系［5-6］。制药工艺综合实验分为化学制药和生物制药两条线，现以化学制药中的综合性实验“扑热息痛的合成及表征、质量分析、药效学评价、剂型制备及质量评价”为例加以探讨。

扑热息痛，又名对乙酰氨基酚，临床上用于普通感冒或流行性感冒引起的发热、缓解头痛、神经痛、牙痛等，是最常用的解热镇痛药之一［7］。扑热息痛属于乙酰苯胺类解热镇痛药，药理作用是通过抑制环氧化酶，选择性抑制下丘脑体温调节中枢前列腺素的合成，导致外周血管扩张、出汗而达到解热的作用；通过抑制前列腺素等的合成和释放，提高痛阈而起到镇痛作用，属于外周性镇痛药，仅对轻、中度疼痛有效，无明显抗炎作用［8-9］。市面上有对乙酰氨基酚的各种剂型，如对乙酰氨基酚片、对乙酰氨基酚缓释片、对乙酰氨基酚颗粒、对乙酰氨基酚混悬液、对乙酰氨基酚栓等。以学生熟悉的经典药物扑热息痛为切入点，模拟药物研发的整个历程，开设了融合药学四大主干课程知识的综合设计性实验，对提高学生药品研发、生产、检验的整体认知，提升学生综合运用知识解决问题的能力，培养高素质复合型药学人才具有重要意义。

1 教学设计与安排

扑热息痛综合性实验以模拟药物研发为主线，旨在交叉融合药学多学科理论知识与实验操作，提高学生综合运用所学知识分析解决问题的能力。实验内容主要有合成扑热息痛原料药，并对其结构表征，灌输药化科研思维；根据药典对合成的原料药进行质量分析，包括鉴别、检查、含量测定等，植入药物质量分析的思想；考察原料药对小鼠的镇痛作用，引入药效学评价理念；将原料药制备成合适的剂型，并对制剂进行质量评价，各模块之间相互影响、联系，实验设计思路如图1所示。

图1 扑热息痛综合实验设计思路

该实验项目面向制药工程专业大学四年级学生开设，安排在大四上学期的综合实训环节。开课前2 周教师将实验项目发给学生，让学生自行查阅文献、书籍等，设计整个实验方案，实验前指导老师与学生开展实验方案的可行性研讨会，结合实验室安全及现有条件，最终确定具体的实验方案。整个实验过程遵循以学生为主，充分发挥学生的积极主动性，教师陪同引导，实验结束时间由各组的具体进度决定。学生在实验过程中需要认真观察实验现象、写好实验记录，实验操作认真、规范，实验结束后及时完成实验报告，最后各组进行PPT汇报总结。学生除了实验课上跟老师交流，课外还可以通过企业微信跟老师探讨问题。此外，实验期间学院大型分析仪器平台对教学开放，如质谱仪、核磁共振仪、高效液相色谱仪、红外光谱仪等，以保证实验的顺利开展。

该实验安排在连续2 周（10 天）内完成，每组学生4 或5 人，组内学生又可分为两小组，每小组2 或3人，运用对比教学法，每小组学生进行不同合成方法、不同片剂的制备等，汇总组内和全班的实验数据，进行组内、组间数据比较，分析，最终得出实验结果。第1～3天完成扑热息痛的合成、纯化及表征；第4～5 天完成原料药质量分析；第6 天完成扑热息痛的镇痛作用研究；第7～9 天完成扑热息痛普通片、缓释片的制备，质量检查及溶出度测定；第10 天整理实验数据，书写实验报告及制作实验总结PPT。最后，各小组进行PPT汇报答辩，师生讨论交流。实验整体安排较为紧凑，环环相扣，需要各组学生相互配合，分工协作，勇于探索。

2 实验部分

2.1 实验原理

扑热息痛的合成方法较多［10-12］，本项目以对氨基酚为原料，经过乙酸酐酰化后得到目标产物［7，13］，反应方程式如图2 所示。

图2 扑热息痛的合成路线

扑热息痛原料药的质量分析按照药典中的相关规定［14］，根据化合物分子中的酚羟基与铁离子形成配位键而显色；乙酰胺基水解后生成氨基，在亚硝酸钠和碱性β-萘酚的作用下发生重氮化-偶合反应生成红色的偶氮化合物。

扑热息痛的体外镇痛实验采用化学刺激法或者热板法，化学刺激法给小鼠腹腔注射一些化学物质刺激腹膜，引起深部的、大面积且较持久的疼痛反应，致使小鼠产生扭体反应；热板法是通过热刺激小鼠足部产生疼痛反应，即小鼠出现舔后足，测定小鼠出现疼痛舔后足的时间，比较给药组与对照组的差异，判定药物有无镇痛作用。

由于对乙酰氨基酚的生物半衰期短，患者需要频繁服药，容易造成胃肠道刺激等不良反应，制成其缓释制剂具有药效持久，减少给药次数，降低副作用，改善安全性等优点。缓释片的释放度测定，所用仪器和方法同普通片的溶出度测定，释放度的测定采用3 个以上时间点取样。实验测定对乙酰氨基酚普通片的溶出度，及其缓释片的释放度，并且比较两者实验结果，进行缓释作用评价。

2.2 实验材料

试剂对氨基酚，醋酸酐，活性炭，亚硫酸氢钠，三氯化铁，亚硝酸钠试液，碱性β-萘酚试液，溴化钾，氯化钠，硝酸银试液，硫酸钾，甲醇，乙酸钠，对氨基苯酚，氢氧化钠，乙酸，羟丙基甲基纤维素，乳糖，乙醇，硬脂酸镁，盐酸等，均为分析纯。

仪器微波合成仪，超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用仪，核磁共振谱仪，全反射傅里叶红外光谱仪，高效液相色谱仪，热板仪，压片机，溶出仪，片剂硬度测试仪，脆碎度测试仪，分析天平，电子天平，磁力搅拌加热器，循环水真空泵，pH 计，水浴锅，注射器，鼠笼，灌胃针，恒温干燥箱等。

动物ICR 小鼠，雌雄各半，体质量20～25 g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，饲养温度25℃，相对湿度55%。

2.3 实验步骤

2.3.1 扑热息痛原料药的合成及表征［7，13］

向安装配有搅拌子、温度计、回流冷凝管的250 mL三颈瓶中加入44 g对氨基苯酚和120 mL纯水，开启搅拌，加热到50 ℃；通过恒压滴液漏斗逐滴加入48 mL乙酸酐然后升温到80 ℃，维持该温度反应2 h。冷却到室温，待结晶析出完全后，抽滤，用冰纯水洗涤滤饼两次，抽干得对乙酰氨基酚粗品。将粗品转移至250 mL圆底烧瓶中，加入适量纯水，加热溶解，稍冷后加入4 g活性碳，回流15 min，事先在抽滤瓶中先加入1 g亚硫酸氢钠，趁热抽滤，滤液趁热转移至500 mL烧杯中，放冷析晶，抽滤，滤饼用0.5%亚硫酸氢钠溶液洗涤2 次，抽滤，干燥，得到扑热息痛原料药。测熔点，计算收率，并通过质谱、氢谱和碳谱进行化合物的表征，以及高效液相色谱法进行纯度检测。

微波合成法是向250 mL三颈瓶中加入搅拌子，44 g对氨基苯酚和120 mL纯水，稍加摇晃后放置微波合成仪中，安装好回流冷凝管，设置好反应时间17 min，微波功率500 W，反应温度100 ℃，滴加乙酸酐，同时开启微波反应，反应完毕冷却析晶，后续操作同上。

2.3.2 扑热息痛原料药的质量分析［14］

（1）鉴别。①取原料药的水溶液，加三氯化铁试液，样品溶液显蓝紫色。②取原料药约0.1 g，加稀盐酸5 mL，水浴中加热40 min，冷却至室温；取0.5 mL该溶液，滴加亚硝酸钠试液5 滴，摇匀，加去离子水3 mL稀释，加碱性β-萘酚试液2 mL，振摇，应显红色。③取原料药干燥品1～2 mg，与200 mg左右的溴化钾混合，研磨成细粉，在红外压片模具中压成透明薄片，置于傅里叶红外光谱仪中进行检测，获得的红外光谱与标准图谱进行对照。

（2）检查。①酸度。取原料药0.1 g，加水10 mL使溶解，使用校正好的pH 计，测定pH 值应为5.5～6.5。②氯化物。取原料药2.0 g，加水100 mL，加热溶解后，取滤液25 mL再加稀硝酸10 mL，置50 mL纳氏比色管中，加水至约40 mL，摇匀，得到供试品溶液。另取5 mL标准氯化钠溶液，分别加入硝酸银试液1.0 mL，用水稀释成约50 mL，摇匀，在暗处放置5 min，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察、比较。③硫酸盐。量取氯化物检查时剩余的滤液25 mL，与标准硫酸钾溶液1.0 mL制成的对照液比较。

（3）含量测定。采用紫外分光光度法，取扑热息痛原料药约40 mg，精密称定，置于250 mL容量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液50 mL溶解后，加水至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置于100 mL量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液10 mL，加水至刻度，摇匀。272 nm处进行紫外分光光度测定。

2.3.3 扑热息痛的镇痛作用研究［13］

采用化学刺激法取小鼠4 只，雌雄各半，称重并编号，实验组小鼠（雌雄各半）编号为1，2 号，皮下注射对乙酰氨基酚0.15 mL／10 g；对照组小鼠（雌雄各半）编号为3，4 号，皮下注射生理盐水0.15 mL／10 g。30 min后，每只小鼠分别腹腔注射0.2 mL的0.8%乙酸，观察15 min内每只小鼠发生扭体反应的次数。观察小鼠给药前后的表现，并仔细记录观察结果，计算镇痛反应百分率（%）。

2.3.4 扑热息痛片剂的制备及质量评价［13，15］

（1）处方。对乙酰氨基酚缓释片和普通片的处方组成如表1 所示。

表1 扑热息痛片剂的处方

（2）剂型制备工艺流程。对乙酰氨基酚普通片和缓释片的制备采用湿法制粒，流程为原辅料粉碎—过筛—原辅料混合—制软材—制粒—干燥—整粒—混合—压片。

（3）扑热息痛缓释片、普通片质量研究。①外观检查。取20 片，平铺于白底板上，置于75 W 光源下60 cm处，距离片剂30 cm，以肉眼观察30 s。检查结果应符合：完整光洁，色泽一致；80～120 目色点应＜5%，麻面＜5%，并不得有严重花斑及特殊异物。②重量差异限度检查。取20 片，精密称重总重量，求得平均片重后，再分别精密称定各片的重量。每片重应与平均片重相比较，超出重量差异限度的药片不得多于2 片，并不得有1 片超出重量差异限度的1 倍。③硬度检查。取6 片，用片剂硬度测试仪测定硬度。④脆碎度检查。取10 片，精密称重，置于脆碎度测试仪，规定时间取出，除去粉末，精密称重，减失重量不得超过0.8%，且不得检出断裂、龟裂及粉碎的片。⑤释放度检查。取自制缓释片6 片，采用浆法，以900 mL 磷酸盐缓冲液（pH5.8）为释放介质，转速为50 r／min，在5、10、20、30、60、90、120、180、210 min，分别取5 mL溶液，滤过，精密量取续滤液1 mL，加上述释放介质稀释50 mL，摇匀，照紫外-可见分光光度法，于波长257 nm处测量吸光度。⑥溶出度的测定。取自制普通片6片，采用转篮法，以稀盐酸24 mL 加水至1 000 mL 为溶出介质，转速为100 r／min，分别于5、10、15、30、45、60 min取溶液5 mL，滤过，精密量取续滤液1 mL，加0.04%氢氧化钠溶液至50 mL，摇匀，按照紫外-可见分光光度法，于波长257 nm处测量吸光度。

3 实验结果与分析

3.1 扑热息痛原料药的合成与表征

对比两种合成方法，微波合成法的反应时间大大缩短，操作简便，收率略高。合成得到的扑热息痛原料为白色结晶，计算收率为61%～75%，通过数字熔点仪测定熔点为169～170 ℃，与文献值相符［16］。此外，学生需要预处理好样品，在分析检测平台老师的指导下使用质谱仪、核磁共振仪、高效液相色谱仪等，完成对化合物的结构表征和纯度分析，并通过谱图解析，验证产物结构及纯度。

经质谱仪测定化合物相对分子质量为151，与对乙酰氨基酚相对分子质量相符，质谱图如图3 所示。

图3 扑热息痛的质谱图

经核磁共振分析仪测试得到化合物的氢谱和碳谱，1H-NMR（400 MHz，CD3OD）：δ 7.3（d，2H）和δ 6.75（d，2H），这为苯环上的4 个氢；δ 4.8（s，2H）为氨基成铵盐上的2 个氢；δ 2.1（s，3H）为甲基上的3 个氢；13C-NMR（400 MHz，CD3OD）：δ 170.0 为羰基碳，δ 154.0 为苯环上连接羟基的碳，δ 130.3 为苯环上连接氨基的碳，δ 122.0 和δ 114.8 为苯环上无取代基的4个碳，δ 22.1 为甲基碳，与对乙酰氨基酚结构相符，其氢谱、碳谱如图4 所示。

图4 扑热息痛的核磁谱

采用高效液相色谱法进行纯度测定，色谱柱为Waters XBridge C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）；流动相为甲醇－0.05 mol／L醋酸铵溶液（15∶85）；流速为1.0 mL／min；检测波长为257 nm；柱温为35 ℃；进样量为10 μL，面积归一化法得到对乙酰氨基酚的纯度达99.7%，如图5 所示。

图5 扑热息痛原料药的高效液相色谱图

3.2 扑热息痛原料药的质量评价

3.2.1 鉴 别

扑热息痛原料药与三氯化铁显蓝紫色；经酸解与亚硝酸钠作用显红色；红外光谱图与文献图谱［17］基本一致，如图6 所示。

图6 扑热息痛的红外光谱图

3.2.2 检 查

扑热息痛原料药经酸度检查合格，大部分学生的氯化物检查、硫酸盐检查合格，少数学生的不合格，可能在制备原料药的过程中使用了自来水，或者产品洗涤不充分而引起氯化物、硫酸盐的残留。

3.2.3 纯度测定

扑热息痛原料药的含量在90%～105%，符合药典规定，部分学生的数据如表2 所示。

表2 对乙酰氨基酚的含量

3.3 扑热息痛原料药的药理学评价

统计全班小鼠的扭体次数，计算对乙酰氨基酚的镇痛百分率，结果如表3 所示。由表可知，对乙酰氨基酚对小鼠有明显的镇痛作用。

表3 对乙酰氨基酚对小鼠的镇痛作用

3.4 扑热息痛普通片、缓释片的制备及质量评价

制备得到的扑热息痛普通片、缓释片完整光洁，色泽一致，无花片裂片，外观检查合格；重量差异检查合格，部分学生制备的缓释片数据如表4 所示；普通片、缓释片的硬度、脆碎度检查均合格。

表4 扑热息痛缓释片的重量差异限度检查

计算普通片、缓释片在各取样点的药物溶出度及累积溶出度，绘制的累积溶出度-时间曲线图如图7 所示。由图可知，扑热息痛缓释片较普通片药物释放明显缓慢，在3 h 时累积释放度为50%，达到了缓释效果。

图7 扑热息痛累积溶出度-时间曲线图

4 结 语

设计实验从扑热息痛原料药合成，经药品质量分析，再进行药理学活性评价，到最后片剂的制备及质量评价，实验内容丰富多样，涉及的专业知识广泛，涵盖了多学科的理论知识及实验技能，不仅让学生对大学4 年所学知识进行了整体梳理和巩固，还加深对新药研发历程的理解。此外，该课程对提升学生综合实验技能、专业知识的融会贯通、科研素养以及分析解决问题的综合能力都大有裨益，也为学院培养应用型、复合型高素质药学人才提供了重要支撑。经过3 年的教学实践，取得了很好的教学效果，获得师生的一致好评，已成为我院具有特色的专业实践实训课程。今后，该课程还会继续更新完善，与时俱进，例如引入绿色合成新技术（微流控技术、电化学合成法等），增加不同剂型的制备（混悬剂、颗粒剂、栓剂等），同时融入更多的思政元素，培养学生“药者仁心、精业济世”的家国情怀和使命担当。