外周血单个核细胞非编码RNA作为类风湿关节炎标志物的研究进展*

王彬宇,张 敏,迟伟群 综述,刘 禹 审校

哈尔滨医科大学附属第四医院检验科,黑龙江哈尔滨 150000

类风湿关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性疾病,特征是持续性的滑膜炎、全身炎症反应和自身抗体的产生。炎症反应和免疫紊乱是RA发病的重要原因,但RA确切的发病机制和病因尚未完全阐明[1]。早期诊断和治疗RA可提高临床疗效,预防关节的不可逆损伤。然而当前对于RA的诊断往往在疾病后期,且存在灵敏度和特异度不足的问题。目前,RA的常用实验室检测指标包括红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)和抗环瓜氨酸肽抗体(ACPA)等,而它们对于RA的诊断效果并不理想。RF的灵敏度仅为49%～56%[2];ACPA的特异度可达95%,但灵敏度只有67%[3];ESR、CRP则缺乏特异性。因此,探寻新的RA生物标志物对于该病的早期诊断和治疗至关重要。

目前,仅1.5%～2.0%的人类基因组编码蛋白质,而75%～90%的DNA转录产生非编码RNA[4]。非编码RNA不通过编码蛋白质影响机体状态,但其本身可参与RNA的转录修饰、细胞通路的信号调节等。作为RA病理机制中不可或缺的一部分,非编码RNA与RA的起病、发展、治疗、预后等密切相关,成为当下研究的热点。本文通过分析近年来外周血单个核细胞(PBMC)非编码RNA作为RA生物标志物的实验研究进展,进而探讨诊断RA的更多潜在标志物。

1 非编码RNA与RA

非编码RNA由tRNA、rRNA以及两组调节性RNA[小非编码RNA和长非编码RNA(lncRNA)]组成。小非编码RNA是一组长度小于200 nt的转录物,主要是微小RNA(miRNA)、小干扰RNA、与piwi蛋白相作用RNA(piRNA),还包括小核仁RNA和其他短RNA[5]。miRNA可以通过RNA干扰途径诱导mRNA降解、翻译或抑制,其表达失调可能与固有免疫、炎症反应和细胞增殖等异常改变有关[6]。长度超过200 nt且缺乏蛋白质编码潜力的RNA转录物被称为lncRNA,它们具有多样化的功能,如调节DNA合成,转录、翻译RNA和保护基因组免受病毒DNA的伤害[7]。一些非编码RNA是RA的特异性标志物,主要包括miRNA、lncRNA和环状RNA(circRNA)。miRNA作为非编码RNA是研究中的热门领域,已经完全展现出其与RA病理特性的相关性,特别是miR-155、miR-221、miR-222等[8-9];有研究也证实了肿瘤坏死因子-α和异质核糖核蛋白L抗体相关免疫调节长非编码RNA(THRIL)和lncRNA H19等与RA疾病进展相关[10-11];而circRNA相关研究中,被研究得最广泛的是ciRS-7[12]。

2 PBMC在RA中的作用

PBMC主要包括淋巴细胞和单核细胞。淋巴细胞包含T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞等。单核细胞进入外周组织后会转变为巨噬细胞,巨噬细胞非特异性地吞噬并消化外来病原体、自身衰老细胞及肿瘤细胞。对于自身无法处理的病原体,巨噬细胞将其作为抗原呈递给T淋巴细胞,T淋巴细胞再选择性地分化为调节性T淋巴细胞或杀伤性T细胞,刺激B淋巴细胞分化、分泌抗体或直接杀伤病原体。PBMC相互协作构成机体免疫系统中重要组成部分。RA作为一种自身免疫性疾病,其病理机制与体液免疫、细胞免疫密切相关。KANE等[13]发现,PBMC上非整合层黏蛋白受体下调脂多糖诱导肿瘤坏死因子(TNF)-α的产生,该层黏蛋白被认为在RA的发病过程中起了关键作用;GOLINSKI等[14]进行的RA组与健康组的对照研究发现,RA组中T、B淋巴细胞上的Ras蛋白特异鸟苷酸核苷酸释放因子(RasGRP)1被抑制,导致自身反应性CD4+T淋巴细胞的产生从而提高B淋巴细胞活性,而RasGRP3表达上升提高了B淋巴细胞对T淋巴细胞的敏感性。这两种机制共同作用或许导致了RA的发生。此外,调节性T淋巴细胞与RA的病理机制也有相关性[15]。PBMC在RA的发生、发展和治疗中都有重要作用,因而在RA生物标志物的分析中具有广阔前景;同时,非编码RNA广泛参与转录调控,具有结构稳定、对机体状况反应迅速等优势,因此,研究PBMC非编码RNA有望为临床提供更具说服力与应用价值的生物标志物。

3 PBMC非编码RNA作为RA生物标志物

近年来,以非编码RNA作为生物标志物的研究有很多,但多数是针对血清或组织非编码RNA的研究,而PBMC非编码RNA的研究对于自身免疫性疾病——RA有特殊意义。例如:miR-155、miR-146a等可调节辅助性T淋巴细胞的分化与功能,影响炎性因子释放[16];miR-155介导B淋巴细胞的成熟和抗体分泌;miR-548a-3p、miR-6089等作用于Toll样受体影响PBMC的功能[17]。它们都参与了RA的病理过程。近年来有研究发现,miRNA在RA患者PBMC中的表达水平可以反映滑膜组织炎症及损伤情况,对于某些没有条件或不接受有创手术提取滑膜组织的患者,研究者可以提取PBMC进行替代[18]。

3.1PBMC中的miRNA与RA 在健康人群中,miR-221、miR-222可以调节血管生理功能,如血管生成、血管创面愈合、血管老化、动脉粥样硬化、血管重构等。它们均来自一种重要的致癌基因,在动脉粥样硬化、RA等炎性疾病中发挥着重要作用[19],但其在RA中的具体机制仍未探知。ABO EIATLA等[8]分析30例RA患者和20例无自身免疫疾病史的健康者PBMC中miR-221和miR-222的表达水平发现,RA患者2项指标的表达水平均升高且互为正相关并随疾病活动度升高而升高,诊断RA的灵敏度分别为70%、80%,特异度分别为75%和70%。因此,下一步对它们进行联合检测将有助于RA的实验室诊断。

miR-155被认为能调控固有和适应性免疫细胞的分化和激活,调节生发中心T淋巴细胞稳态,并可通过负调控转录因子PU.1从而促进B淋巴细胞增殖和抗体产生[20]。近期一项对67例RA患者、55例健康者、54例脊柱关节炎及相关结缔组织病患者的对照研究结果显示,RA患者PBMC中miR-155水平显著升高,且通过抑制CCAAT增强子结合蛋白抑制M2型巨噬细胞分化,导致单核细胞中TNF表达上升,促进RA疾病进展[9]。

作为miRNA中庞大的分支,有研究已证实miR-29家族在骨关节炎、骨质疏松症、心肾疾病以及免疫疾病群体中的差异表达及其作用机制[21]。近期REN等[22]发现,miR-29b在RA患者单核细胞中表达上升,差异倍数(FC)为2,通过抑制HMG盒蛋白1表达而抑制单核细胞凋亡,致使TNF-α分泌增加,进一步刺激miR-29b转录。这一正反馈网络为研究RA的疾病发展机制又提供了一条思路。

miR-128-3p在各种组织、原代小鼠细胞、病理小鼠和人类血液标本中表达,影响血管平滑肌细胞的增殖、迁移、分化和收缩能力,受应激后表观遗传修饰的调控,证实其在疾病背景下的调节可用于治疗目的[23]。XIA等[24]检测发现,RA患者PBMC中miR-128-3p的表达水平上升(FC为4),经由TNF诱导蛋白3,激活T淋巴细胞和核因子(NF)-κB通路,增强炎症反应。miR-128-3p可成为研究RA炎症控制和治疗的又一靶点。

靶向于视黄酸受体α的miR-146b在RA患者单核细胞中呈高表达(FC为2),且与视黄酸受体α基因表达水平呈负相关(r=-0.45),同时其转录过程中的水平在RA患者滑膜组织(FC为7.9)及滑膜液(FC为205)中显著上升[25]。对miR-146b的深入研究可能预测RA对患者关节滑膜的损伤情况。

此前,miR-34a被证实通过与lncRNA及各种通路的相互作用,影响肿瘤增殖[26]、肝肾纤维化[27-28]等。KUROWSKA-STOLARSKA等[29]分析miR-34a在RA患者和健康人群PBMC中的表达水平发现,其在CD1c+树突细胞中表达水平上升(FC为5),通过作用于酪氨酸蛋白激酶受体提高树突细胞的活性,促进关节炎症的发展。

PBMC中miRNA的表达水平变化有助于RA的早期诊疗及病情判断。miR-221、miR-222、miR-155和miR-146b在RA的诊断中已展现出强大的潜力,而对miR-29b、miR-128-3p、miR-34a等的研究也不容忽视,PBMC中miRNA的表达水平与RA的发病机制有着紧密联系,进行更深一步的探究有助于开发新的RA生物标志物。

3.2PBMC中的lncRNA与RA MOHARAMOGHLI等[30]发现,相较于健康人群,RA患者T淋巴细胞中生长抑制特异性基因(GAS)5水平上升了3.31倍,加工核糖核酸内切酶的线粒体RNA组分(RMRP)水平上升了2.43倍,THRIL水平上升了2.14倍。GAS5作为糖皮质激素受体的阻遏物,与受体的DNA结合域结合,并阻止其与DNA的相互作用[31],而糖皮质激素是治疗炎性疾病最有效的药物,GAS5的过表达可能导致包括RA在内的一些疾病对糖皮质激素的治疗抵抗。这提示在免疫细胞中观察到的GAS5水平增加有抑制糖皮质激素的作用,从而促进包括RA在内的自身免疫性疾病的发展。RMRP作为辅助性T淋巴细胞(Th)17中维甲酸相关孤核受体γt转录因子组装和活性调节不可或缺的调控因素可有效促进Th17引起的炎症反应,且RMRP水平与RA的病情严重程度呈正相关。THRIL与异质核核糖核蛋白L形成RNA-蛋白复合物,可调节先天免疫系统中TNF-α的表达,而TNF-α的表达与RA的病情进展密切相关。随后的受试者工作特征(ROC)曲线分析也显示GAS5[曲线下面积(AUC)=0.75]、RMRP(AUC=0.70)和THRIL(AUC=0.70)具有诊断RA的潜力。

lncRNA γ干扰素编码基因反义RNA1(IFNG-AS1)作为γ-干扰素转录的关键因子,有研究发现,其在RA患者PBMC中呈高表达(FC为3),且与ESR(r=0.382 1)、CRP(r=0.475 1)、RF(r=0.511 8)、T淋巴细胞表达的T盒子转录因子(T-bet,r=0.692 3)水平呈正相关,敲除T-bet后IFNG-AS1水平呈明显下降趋势。这证明IFNG-AS1的转录依赖于Th1中T-bet的激活,进一步构建的ROC曲线分析证明了其诊断的有效性(AUC=0.815,灵敏度为53.33%,特异度为96.77%)[32]。

MESSEMAKER等[33]发现,C5T1 lncRNA在RA的PBMC中高表达,且在特异性免疫刺激下其表达水平进一步升高;同时,敲除C5T1 lncRNA会导致补体C5 mRNA水平下降,进而促进RA疾病进展。这展现了C5T1 lncRNA未来有作为RA诊断标志物的潜力。

ZHANG等[34]检测65例RA患者和54例健康对照者PBMC中lnc0640和lnc5150发现,RA患者PBMC中lnc0640表达水平上升,而lnc5150表达水平下降,且这二者都与CRP水平相关,同时lnc5150表达水平与ESR相关,lnc0640和lnc5150可能通过丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路参与RA的病理过程。lnc0640和lnc5150表达水平与RA患者几种临床指征显著相关,提示这些lncRNA可能被用作新的RA诊断标志物。

作为一种长链非编码RNA,lncRNA的检测相较于miRNA和circRNA更简便、易行,在标本储存、运输过程中也更少降解,若能将其推广到临床应用,将会对RA早期诊断和治疗有极大帮助,但其在实验中也有低保守性、结构功能冗杂等缺陷,尚待未来进一步完善。

3.3PBMC中的circRNA与RA ciRS-7是一种内源性circRNA,具有封闭的环状结构,可以作为miRNA海绵,在调控RNA转录、下游基因表达和蛋白质生成中起着至关重要的作用。此外,ciRS-7作为一种致癌基因,在各种类型的癌症中通过竞争性抑制miR-7促进肿瘤进展[35]。TANG等[12]发现,在RA患者PBMC中ciRS-7表达水平上升(FC为5),增强的ciRS-7表达抑制了miR-7的功能,缓解了miR-7对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的抑制作用,而人磷脂酰肌醇三羟基激酶/mTOR信号通路激活能导致RA患者滑膜成纤维细胞异常增殖,促进RA的病情进展;同时研究者评估了ciRS-7作为RA诊断标志物的有效性(AUC=0.766,灵敏度为77.8%,特异度为78.6%)。

circPTPN22被认为是一种新型的RA诊断生物标志物,并可能通过“海绵”作用参与RA的起病。JIANG等[36]验证circPTPN22在42例RA患者、44例健康者和45例系统性红斑狼疮(SLE)患者中的表达发现,与健康者相比,circPTPN22在RA和SLE患者中表达水平均升高。ROC曲线分析提示,circPTPN22对区分RA患者、健康者及SLE患者具有鉴别诊断价值。此外,circPTPN22在RA PBMC中的水平与ACPA、RF、CRP等多种因素相关。随后筛选了4个假定的miRNA(hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-766-3p和hsa-miR-34c-5p),使用circPTPN22对其进行海绵吸附,结果显示,与对照组相比,其在RA患者PBMC中的表达水平上调。

近年来微阵列表达谱在circRNA中的应用十分广泛。LU等[37]通过微阵列筛选出149个表达水平上调和250个表达水平下降的circRNA,进一步行PCR筛选出差异表达上升最显著的circRNA_101328(FC为-4),其诊断RA的灵敏度和特异度分别为95.2%、95.0%,基因本体数据库分析发现,其机制可能与MAPK信号通路有关。

CHEN等[38]通过微阵列筛选出162个差异表达circRNA,挑选出其中一个来自X染色体的hsa_circ_0140271进行RA组(47例)与健康组(47例)的对照研究发现,其在女性RA患者PBMC中出现高表达(FC为2),而男性RA患者与健康者无异,构建ROC曲线发现,其对于RA与其他疾病的鉴别诊断更有意义(RA-健康组AUC=0.704,RA-强直性脊柱炎组AUC=0.922,RA-骨性关节炎组AUC=0.868),且其表达水平与炎性细胞因子水平相关。进一步分析显示,hsa_circ_0140271可能通过调节脂肪酸代谢影响RA疾病进展。WEN等[39]通过实验检出hsa_circ_0001200、hsa_circ_0001566、hsa_circ_0003972和hsa_circ_0008360在RA组中高表达(FC分别为4、3、4、-8),且均与RA疾病活动度指标具有相关性,进一步生物信息学分析提示它们可能参与凋亡、自噬、免疫、炎症反应、氧化应激等,而这些机制都与RA发生、发展有密切联系。

关于circRNA在调节自身免疫和炎症中的下游信号通路目前还知之甚少,未来需要进一步探讨。相较于研究较为热门及成熟的miRNA,通过靶向circRNA研究RA的诊断和治疗具有更广阔的前景。

4 小 结

非编码RNA已成为许多科学领域的研究热点,其在调节炎症和自身免疫中的作用受到广泛关注。而PBMC在自身免疫疾病中的作用也不容忽视:Th17/Treg细胞比例失衡导致机体炎性环境的产生,促炎的T淋巴细胞分泌更多炎性细胞因子,失控的B淋巴细胞产生大量自身抗体。同时PBMC因其内含的丰富而多样的生物标志物及较为便捷的提取方法已被作为标志物及机制探究实验中的重要研究对象。

目前,血清RF或ACPA阳性并不足以诊断RA。许多健康者RF和ACPA呈阳性,而它们在部分RA患者血清中呈阴性。此外,许多临床表现为关节炎的患者,其实验室诊断指标却不符合RA的诊断标准。1987年美国风湿病学会提出的RA分类标准给出了7条建议,符合4条及以上者可诊断为RA,其灵敏度为39.1%,特异度为92.4%;2010年美国风湿病学会联合欧洲抗风湿病联盟提出的RA分类标准,将原标准改为了4条评分项目,累计评分≥6分可诊断为RA,其灵敏度为72.3%,特异度为83.2%[40]。在1987年的7条建议中,实验室指标只有1项,而在2009年的标准中,增加了ACPA、CRP和ESR这几个项目,实验室指标在RA分类标准中的占比大大提高,虽然特异度小幅度下降,但灵敏度明显提升。研究数据表明RA患者和健康者PBMC中的非编码RNA水平存在差异,它们表达水平的变化不仅可用于RA早期诊断,还对RA的鉴别诊断、疾病活动度及严重程度的评估也具有重要价值。希望对RA新型标志物的研究能够进一步改进疾病的分类标准。

未来的挑战将是识别非编码RNA调节免疫反应的机制,提供更多可能的诊断指标。探究非编码RNA生物化学、结构及其相互作用,分析执行非编码RNA生物学功能的特定功能序列和结构域有助于揭示更多非编码RNA相关机制。研究患者与健康者个体免疫细胞亚型或损伤组织中差异表达的非编码RNA,有助于诊断RA。疾病相关的功能性非编码RNA有作为疾病生物标志物和治疗靶点的潜力,随着研究的深入,它们有望作为RA诊断、疗效观察及预后的有效工具。