铁死亡与免疫检查点在肿瘤中的相互作用

许业炽，朱汝森，黄仲凯，徐寿雨，孙之晗，赵苡洁

广东医科大学附属医院神经外科，广东 湛江 524000

铁死亡是由Erastin、索拉菲尼、柳氮磺吡啶、RSL3等诱导的铁依赖性脂质过氧化驱动引起质膜破裂的调节性细胞死亡形式，在形态学和机制上不同于其他调节性细胞死亡(RCD)[1-2]，从至少三个途径参与铁死亡的发生与调控，分别是脂质代谢途径、铁代谢途径和抗氧化屏障[3]。免疫检查点为抑制性免疫受体和抑制信号通路，在正常情况下能抑制T细胞的功能，同时在肿瘤组织中可以被利用造成免疫逃逸。近几十年来已有很多免疫检查点被鉴定和研究，包括PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、TIGIT和BTLA等。本文综述将描述铁死亡与免疫检查点在肿瘤中相互作用情况，并论述其中可能参与的机制，以及在肿瘤治疗上的意义。

1 铁死亡的发生机制

1.1 铁代谢 铁过量能促进自由基生成和脂质过氧化，从而诱发铁死亡[4]。铁离子在十二指肠及空肠上段以Fe2+形式经主动转运吸收，吸收后的Fe2+经铜蓝蛋白氧化为Fe3+并与血浆中的转铁蛋白以2：1比例结合后转运到各组织中。到达组织后的转铁蛋白-Fe3+复合物与细胞膜上的转铁蛋白受体(TFR)结合进入细胞内，Fe3+再次还原为Fe2+。而胞内Fe2+与胞内铁蛋白结合防止被氧化。铁蛋白是一种由FTH1和FTL组成的铁储存蛋白复合物，可防止Fe2+被活性氧(ROS)氧化[3]5。而铁蛋白自噬可使Fe2+释放[5]，Fe2+的释放是诱导脂质过氧化导致铁死亡所必需的。而Fe2+主要通过细胞膜上的SLC40A1 输出[6]，也可通过外泌体形式将铁蛋白输出[7]。因此通过对铁代谢过程的干预可促进或抑制铁死亡的发生。癌细胞对于铁元素的需求远远高于正常细胞或良性肿瘤细胞，然而过量的铁会诱发铁死亡。因此恶性肿瘤细胞较良性肿瘤细胞或正常细胞更容易发生铁死亡。过量的铁至少可以通过两种机制促进脂质过氧化，包括铁依赖的芬顿反应和含铁酶如脂氧合酶的激活[8]，而芬顿反应产生大量ROS 使脂质过氧化。

1.2 脂质代谢 铁死亡的显著特点是不受控制的脂质过氧化，特别是多不饱和脂肪酸(PUFAs)，如花生四烯酸(AA)和肾上腺酸(AdA)，多不饱和脂肪酸(PUFAs)在细胞膜的生物合成和重构需要酶ACSL4和LPCAT3[3]。ACSL4 使游离的AA 和AdA 及CoA 分别结合生成AA-CoA 和AdA-CoA。然后LPCAT3 分别酯化AA-CoA 和AdA-CoA 生成AA-PE 和AdA-PE，然后掺入细胞膜，并通过酶促和非酶促机制进行脂质过氧化[9]。因此通过药物(如罗格列酮)作用于此过程的关键酶ACSL4或LPCAT3从而影响铁死亡[10]。在非酶自氧化过程中，游离Fe2+与过氧化氢(H2O2)反应生成的羟基自由基[11]使多不饱和脂肪酸(PUFAs)发生脂质过氧化反应。Yang 等[8]研究发现，脂氧合酶通过PHKG2 依赖性铁池氧化PUFA 是铁死亡所必需的。

1.3 抗氧化屏障 在脂质过氧化过程中，相应的抗氧化屏障会保护机体免受过氧化损害。其中抗氧化酶GPX4 发挥着重要作用。GPX4 是一种进化上高度保守的酶，利用谷胱甘肽将过氧化物(例如R-OOH)还原为相应的醇(R-OH)[12]。因此，GPX4 是抗氧化屏障至关重要的一环，可以防止过量ROS 积累，从而阻断过氧化、铁依赖、非凋亡模式的细胞死亡，即铁死亡。GSH 由半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸组成，其表达和活性依赖于GSH和硒的存在。因此半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸代谢可影响抗氧化屏障，其中又以半胱氨酸代谢最为重要。半胱氨酸和胱氨酸可通过氧化还原反应互相转换，而胱氨酸(半胱氨酸的氧化形式)通过细胞膜上的System xc-(由SLC7A11 和SLC3A2 组成)系统将谷氨酸和胱氨酸以1∶1 形式进行交换[13]，从而为合成GPX4 提供“原材料”。因此通过影响以上相关环节可促进铁死亡。另一方面，相关转录因子如ATF4、NRF2 可诱导SLC7A11 转录从而抑制铁死亡，而p53 抑制SLC7A11 转录[14]。经典铁死亡激活剂Erastin 正是通过抑制System xc-介导的胱氨酸输入[15]，从而诱导铁死亡，RSL3 则直接抑制GPX4而促进铁死亡[16]。

2 肿瘤中的铁死亡

尽管临床上基于铁死亡对肿瘤的治疗仍较少，但基础研究中关于肿瘤铁死亡的研究却越来越多。临床上研究大多集中在铁死亡发生机制的“关键点”上，包括ROS 水平、抗氧化屏障、脂质代谢、关键蛋白受体等。例如，双氢青蒿素(DHA)在引起胶质瘤内质网应激(ER)产生大量ROS 和脂质过氧化的同时通过PERK-ATF4-HSPA5-GPX4 轴中和了DHA 诱导的脂质过氧化作用，而抑制此通路会通过增加体内和体外的铁死亡作用而增加胶质瘤细胞对DHA的敏感性[17]。ACSL4 通过激活铁死亡途径达到抗增殖作用[18-19]。而治疗胶质瘤的一线药物替莫唑胺，其作用机制可能使通过增加ROS水平而引起铁死亡[20-21]。泛素水解酶(OTUB1)通过直接与SLC7A11 相互作用来稳定SLC7A11，而OTUB1 的敲低则可引起依赖于SLC7A11 的铁死亡[22]。可见，现阶段对于肿瘤铁死亡的研究主要集中在铁死亡发生机制的关键节点上，仍有很大的研究空间，特别是对于恶性肿瘤，仍需要开发更多的有效且高效的治疗药物。

3 肿瘤细胞中的免疫检查点

虽然细胞表达的免疫检查点大致作用是让自身不受免疫细胞的杀伤从而得以“生存”，但作用机制却截然不同，并且不同肿瘤细胞表达的免疫检查点种类也不一样。

PD-1 表达于活化T 细胞，其配体为PD-L1 和PD-L2。恶性肿瘤如胶质瘤大多具有免疫逃逸的特性，其中PD-1/PD-L1 轴发挥关键作用。关于恶性肿瘤PD-1/PD-L1 免疫逃逸和PD-L1 表达上调的机制，有研究推测是肿瘤浸润T 细胞(也包括NK 细胞)分泌的IFN-γ使得肿瘤细胞表面PD-L1 高表达，高表达的PD-L1 与PD-1 结合后诱导T 细胞凋亡，从而使得肿瘤细胞免疫逃逸[23]，这一过程也可被相关药物所逆转[24]。从转录水平上，相关物质可通过与免疫检查点PD-L1启动子结合促进PD-L1的转录从而使得恶性肿瘤免疫逃逸[25]。由于恶性肿瘤如胶质瘤具有无限增殖的特性，相对于正常组织细胞而言处于一种“缺氧”状态。Ding 等[26]发现，缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)通过与PD-L1 近端启动子区域直接结合而上调PD-L1 表达，而与单一疗法相比，HIF-1α 抑制剂和抗PD-L1 抗体的联合治疗对肿瘤生长产生更显著的抑制作用。从抗氧化屏障上，GPX4的下调可通过PD-1/PD-L1免疫检查点诱导肿瘤细胞与CD8+T细胞相互作用，触发CD8+T 细胞凋亡[27]。从DNA 甲基化水平上，DNA 甲基化不足使得肿瘤浸润的免疫细胞(TIICs)增加，进而使PD-1/PD-L1表达上调，使得肿瘤免疫逃逸[28]。从上皮间质转化(EMT)上，通过诱发上皮间质转化(EMT)可使肿瘤相关巨噬细胞数量和趋化性增加，而作为PD-1/PD-L1 轴中的介质，肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的浸润和M2极化可能介导肿瘤细胞PD-L1的上调从而达到免疫逃逸[29-30]。

CTLA-4 表达于活化 的CD4+T 细胞和CD8+T 细胞，其配体为CD80 和CD86。Liu 等[31]研究发现，CTLA-4 的表达和胶质瘤密切相关，并与患者生存期成反比。Liu 等[32]发现，可溶性CTLA-4(sCTLA-4)水平较高的肿瘤患者相对于较低水平sCTLA-4 的患者有更短生存期(基于50例不同级别胶质瘤患者与50例健康患者)。

TIM3有多种不同的配体，包括galectin9、phospha-tidylserine (PtdSer)、CEACAM1 以及HMGB1。Sabatos-Peyton 等[33]研 究 推测，PtdSer 与TIM3 的 结 合 对TIM3 阳性树突状细胞(TIM3+DCs)的抗原交叉呈递很重要。Chiba 等[34]报道，HMGB1 和TIM3 结合，抑制死亡肿瘤细胞所释放的核酸向树突状细胞内吞体募集，从而抑制核酸诱导的先天性免疫反应。TIM-3的表达升高预示着肿瘤恶性程度越高[35]。

另外，肿瘤中也存在其他免疫检查点如TIGIT、LAG-3、BTLA。LAG3(又名CD223)主要表达在活化的T 细胞、NK 细胞、B 细胞、浆细胞和树突细胞。LAG3 可通过与MHC II分子的结合，下调T细胞的活性[36]。同时，LAG3 也可增强调节性T 细胞(Treg 细胞)的抑制活性[37]。TIGIT 在淋巴细胞中表达，特别是在效应和调节性CD4+T细胞，滤泡辅助CD4+T 细胞，效应CD8+T 细胞和自然杀伤(NK)细胞中高表达。TIGIT 配体包括CD155 和CD112，其中亲和力CD155＞CD112。TIGIT 高表达于肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)，并参与血液循环[38]。而当TIGIT 抑制剂和其他免疫检查点抑制剂(如PD-1)联合应用时效果比单一疗法要好[39]。

4 免疫检查点与铁死亡相互作用

铁死亡为程序性死亡(RCD)的一种，并且可通过释放炎症介质、细胞因子等改变肿瘤微环境，从而影响着免疫检查点，免疫检查点反过来也可影响着铁死亡。铁死亡和免疫检查点之间的相互作用处于一种“稳态”，并在肿瘤的发生、发展、侵袭等过程发挥着重要作用。当这种“稳态”被破坏，会干扰肿瘤包括代谢、生长等过程。Wang 等[40]发现，肿瘤细胞中的免疫检查点如PD-L1 与大多数铁死亡调控因子(如ACSL4、CARS、NCOA4 等)的表达水平呈正相关，但与HSPB1、MT1G、RPL8、GPX4呈负相关。相反，免疫检查点反过来也可影响着铁死亡。对其他的一些肿瘤细胞而言，应用免疫检查点抑制剂进行免疫治疗的同时，会增加肿瘤细胞内脂质过氧化水平，从而促进铁死亡，其机制可能是免疫治疗激活的CD8+T细胞释放IFN-γ下调SLC3A2和SLC7A11使得抗氧化能力下降从而诱导铁死亡[41]。

铁死亡可增加肿瘤细胞的免疫原性。一方面，铁死亡过程中，通过释放损伤相关分子模式(DAMPs)以及脂质代谢物、细胞因子和趋化因子等[42]引起肿瘤细胞免疫原性细胞死亡(ICD)[43]。肿瘤抗原从肿瘤细胞中释放出来后被抗原提呈细胞(APCs)识别并向特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)提呈，CTLs对其进行识别，启动和激活针对肿瘤细胞特异性抗原的效应T 细胞反应，激活的效应T细胞进入并浸润肿瘤，并识别肿瘤细胞，通过穿孔素和颗粒酶介导的途径或fas介导的途径杀死靶肿瘤细胞[44]。另一方面，铁死亡可刺激肿瘤细胞的MHC-I 表达，上调的MHC-I 同样帮助抗原的启动和提呈[45]，诱导了肿瘤细胞的免疫原性的增加，以及细胞毒T细胞的强肿瘤浸润，并增强抗PD-1抗体的疗效[46]。

IFN-γ是铁死亡与免疫检查点的“交汇点”。IFN-γ是由肿瘤微环境(TME)中活化的T 细胞、自然杀伤(NK)细胞和NKT 细胞产生的一种重要的细胞因子。然而，肿瘤抗原所活化的细胞毒性T 淋巴细胞(CTLs)释放的IFN-γ可促进铁死亡[47]。Zhang等[48]研究发现，PD-L1 抑制剂可促进T 细胞功能的恢复，包括CD4+和CD8+，使得IFN-γ分泌增多，激活STAT1 信号(IFN/JAK/STAT1)，抑制SLC7A11 表达，进而促进铁死亡。而PD-1 抑制剂激活肿瘤浸润的CD8+T 细胞分泌的IFN-γ，可抑制谷氨酸-胱氨酸反向转运体系统(System xc-)的表达，引起肿瘤细胞铁死亡[49]。同样的，发生铁死亡的肿瘤细胞可激活干扰素相关信号、释放IFN-γ及上调MHC-I等[50]。铁死亡通过增加肿瘤微环境(TME)中CD8+活性而不是数量使得IFN-γ和PD-1表达增加[51]。在大多数情况下，IFN-γ被认为是一种抗肿瘤因子。IFN-γ通过上调MHC-I分子来帮助抗原的启动和提呈，它也参与了包括T细胞的分化、激活和稳态[52]。另外，IFN-γ可在转录上上调PD-L1的表达[53]。

LncRNA 在肿瘤与免疫检查点之间扮演着重要“角色”。对于铁死亡与免疫检查点之间的相互作用，lncRNA 同样发挥着重要作用。一些铁死亡相关lncRNA(frlncRNA)与PD-1 的表达呈正相关[54]。Xu等[55]发现，铁死亡相关lncRNA(frlncRNA)信号可影响肝癌细胞对基于免疫检查点(如PD-1、PD-L1、CTLA-4等)的免疫治疗的反应，同时也可作为免疫治疗反应潜在的预测生物标志物[56]和促进免疫细胞浸润包括CD8+T 细胞、CD4+T 细胞、静息记忆T 细胞、调节性T细胞(Tregs)、活化NK 细胞、静息树突状细胞、静息肥大细胞和中性粒细胞[57]。另一方面，铁死亡相关lncRNA(frlncRNA)可以通过重塑肿瘤微环境(TME)并影响基于免疫检查点免疫治疗的抗癌能力[54]。另外，lncRNAs 如LINC00618 可以通过增加脂质活性氧与铁的水平和降低SLC7A11的表达来加速铁死亡[58]，从而影响免疫检查点。

肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)参与铁死亡与免疫检查点之间相互作用。对于一些肿瘤如胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤，铁死亡却通过促进肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)向M2 表型募集和极化，使得肿瘤细胞对抗PD-1/PD-L1 抵抗[59]，同时分泌IL-10 和TGF-β等细胞因子进而降低免疫细胞活性并促进肿瘤发生[60-61]，然而Xu 等[62]的一项研究通过敲除GBM中MXRA8 可诱导铁死亡进而减少M2巨噬细胞的浸润。而对于放射疗法治疗肿瘤过程中，肿瘤细胞释放微粒(RT-MPs)能诱导铁死亡相关免疫原性死亡，并将肿瘤微环境中的M2 极化为M1 和增加PD-L1 表达，增强了后续联合抗PD-1 治疗效果[63]。

5 铁死亡与免疫检查点相互作用的治疗意义

目前单一针对铁死亡或免疫检查点的研究有着较为详细的研究，而在临床中，也有着相关靶向药物的应用。对于免疫检查点，应用最为广泛的为PD-1/PD-L1抑制剂，如信迪利单抗和阿替利珠单抗，主要应用于肝癌、肺癌等肿瘤。索拉非尼是一款多靶点激酶抑制剂，可用于治疗肾癌、肝癌、甲状腺癌等，但同时也是一种铁死亡诱导剂，在治疗过程中，铁死亡也必定发挥着重要作用。然而，对于单用免疫检查点抑制剂或铁死亡诱导剂却存在局限性，即只对部分患者有效且容易耐受。而对于铁死亡与免疫检查点之间的相互作用，却为新的治疗带来曙光，其中最主要的是开发针对两者之间的靶向药，如IFN-γ、frlncRNA、TAMs 等，比起单一针对铁死亡或免疫检查点可能更为有效。

6 展望

肿瘤尤其是恶性肿瘤是一种较为复杂的疾病，其发生发展涉及多个因素和途径，其中包括铁死亡的抑制和免疫检查点表达上调。近些年来基础和临床研究人员对铁死亡和免疫检查点的研究尤为广泛，主要是针对铁代谢、抗氧化屏障、脂质代谢等铁死亡过程关键步骤和免疫检查点相关通路。然而单一针对铁死亡或免疫检查点却存在局限性，即只对表达确切免疫检查点或铁死亡为主要调节性细胞死亡的肿瘤有效，而对其余肿瘤类型效果则较差。铁死亡和免疫检查点两者存在的相互作用在肿瘤的治疗上看到新的曙光。在肿瘤中，铁死亡和免疫检查点通过肿瘤免疫微环境相互作用，在复杂的肿瘤微环境中达到稳态，并维持促进肿瘤生长。通过促进或阻断两者相互作用的物质或通路，使得原有的“稳态”由促进肿瘤生长变为抑制肿瘤生长。了解铁死亡和免疫检查点两者之间的相互作用对于肿瘤的治疗有着重要意义。