肝素非抗凝作用在肝病应用中的研究进展

肖滢 吴治念 王亚东

肝素主要生物学作用是参与调节凝血系统,被临床广泛用于血栓栓塞性疾病与体外循环抗凝。肝素与肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、肝素结合性表皮生长因子(heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor,HB-EGF)、肝素酶(heparanase,HPSE)等具有高亲和力,当肝素与其结合后通过一系列信号通路发挥抑制肝纤维化、减缓肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)进程等不同生物学效应;还可通过干扰细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparin sulfate proteoglycan,HSPG)作用,阻止乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)进入肝细胞;中期因子(midkine,MDK)作为一种肝素结合性生长因子,被认为是更具特异性的HCC标志物。本文就肝素非抗凝作用在病毒性肝炎、肝纤维化、肝细胞癌中的潜在应用价值与相关机制作一综述。

一、肝素参与肝炎病毒感染与抗病毒免疫

HBV、HCV均属嗜肝病毒,为病毒性肝炎主要致病病毒,病毒侵入肝细胞,引起机体免疫应答介导肝细胞损伤及坏死性炎症。HepG2-NTCP细胞常被用于研究HBV体外感染过程。现已证明,HBV借助大包膜蛋白[1]与HSPG低亲和力结合附着在肝细胞表面,后与牛磺胆酸钠共转运多肽(sodium-taurocholate co-transports peptides,NTCP)[2]高亲和力结合后转入肝细胞内,即HSPG可介导HBV在细胞表面附着与入胞。Watashi等[3]研究证实复合聚乙二醇可以通过增强HSPG与NTCP结合,增加病毒吸附和进入,提高HBV感染效率。Schulze等[4]报道HBV进入肝细胞主要依赖于HSPG的GAG侧链,肝素与HSPG结构相似,都有核心蛋白和硫酸化的GAG链,因此可与HSPG竞争性结合HBV,发挥抑制病毒入胞作用,证实高浓度肝素可以抑制HBV感染过程。值得注意的是,Choijilsuren等[5]通过建立一种无聚乙二醇的感染系统模拟体内HBV自然感染过程,观察到生理浓度的肝素以NTCP依赖性方式增强HBV感染。因此,生理浓度肝素是否参与HBV进入人体后对肝细胞的自然感染过程值得确证;且在HBV感染肝细胞过程中,不同浓度肝素最终是发挥增强抑或抑制作用,有待进一步研究证实。除此之外,肝素还抑制HCV感染肝细胞过程。Dubuisson等[6]研究证实,HCV组成成分之一载脂蛋白-E(apolipoprotein E,ApoE)可借助于肝细胞表面HSPG与细胞因子CD81高亲和力结合,继而转入肝细胞内。Bankwitz等[7]将外源性ApoE、HCV和原代人肝细胞共同培养,放大观察ApoE在HCV感染过程中的作用,发现ApoE使HCV感染能力增强8倍;加入肝素时可抵消ApoE增强感染的作用,这一结果与肝素作为HSPG竞争性拮抗剂抑制HCV入胞相关。因此,肝素通过调节ApoE与肝细胞表面相关物质间的作用,可能是抑制HCV感染的有效治疗策略。

众所周知,树突状细胞(dendritic cell,DC)通过识别病原相关模式识别受体发挥抗原递呈作用,Toll样受体家族属该模式识别受体类别之一,参与HBV感染后的抗病毒免疫。CHB患者DC发育成熟障碍、抗原递呈能力缺陷,且Th1/Th2分化失衡[8],伴随TLR2[9]、TLR3[10]、TLR4[11]、TLR9[12]等途径激活免疫应答的能力减弱。研究发现,肝素可用于慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)免疫调节治疗。孙伟红等[10]体外培养来源于CHB患者的DC发现,经肝素处理后的DC其TLR3表达水平明显高于未接受肝素处理的DC,且增强DC释放IL-12的能力,证实肝素在体外通过上调DC的TLR3表达进一步通过IL-12促使Th0细胞向Th1分化,增强机体抗病毒能力。研究表明,HBV衣壳与巨噬细胞结合后通过激活核转录因子κB(NF-κB),释放TNF-α、IL-6和IL-12p40细胞因子。肝素通过调控TLR2信号传导抑制NF-κB激活,减少促炎性因子和调节性细胞因子的释放[13],缓解肝脏免疫炎症损伤。CHB患者肝细胞大量坏死导致肝脏微循环障碍,电镜下能够观察到肝脏窦腔狭窄。肝素通过改善肝脏微循环,促进肝内毛细胆管中淤积胆汁的排泄,保护肝细胞。Shah等[14]利用四氯化碳(CCl4)构建大鼠慢性肝损伤模型,检测到模型大鼠血清TBil、DBil、IBil、ALT、AST、ALP水平升高;在CCl4暴露1周后静脉予以肝素治疗6周,上述肝功能指标水平显著降低,提示肝素可减轻肝细胞损伤。也有国内学者以肝素钠注射液50～100U/kg治疗126例伴有高胆红素血症的CHB患者,除3例患者因出现鼻出血和(或)牙龈出血,复查PT延长至23～25s而停用肝素,其余患者均无明显异常出血现象,且TBil、ALT水平较治疗前明显下降,3个月后随访各项指标仍继续下降[15]。Qiao等[16]利用肝素高生物相容性,制作出包含肝素、重组HBsAg/HBcAg 和分子佐剂(TLR9的激动剂,去甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤寡核苷酸)的治疗性纳米疫苗,可进一步增强治疗性乙肝疫苗的免疫原性,分别使得90%和80%的CHB模型小鼠实现HBsAg清除和血清学转换,也提示肝素在调控抗HBV感染免疫机制中发挥一定作用。

二、肝素调控肝细胞再生与肝纤维化进程

HGF是肝细胞的强效有丝分裂原,通过加速有丝分裂促进肝细胞再生,并可作为受损肝组织修复的重要标志之一。业已证实,肝素可增加HGF的促有丝分裂能力[17-19],但肝素介导细胞行为的分子机制多样。Zioncheck等[18]在体外培养原代大鼠肝细胞时加入HGF与肝素,发现肝细胞有丝分裂程度随肝素浓度增加而增加,其机制在于肝素能够稳定HGF寡聚体、促进HGF特异性膜表面受体c-Met活化,进而促进肝细胞有丝分裂、加速肝细胞再生。Naka等[19]通过制备125I-HGF研究发现,HGF先与细胞表面HSPG结合,后与c-Met蛋白相互作用从而进入细胞;肝素通过干扰HSPG使得超过85%的原本与c-Met结合的HGF从细胞表面释放,增加游离HGF浓度,发挥其诱导肝细胞再生的功能。Kato等[20]研究发现肝素二糖结构重要组分ΔUA-GlcNS可介导HGF浓度增加,其诱导机制包括释放细胞表面结合的HGF和增加细胞内HGF的产生,经ΔUA-GlcNS预处理的小鼠在注射CCl4后24小时检测血清ALT和AST水平以及行肝组织学检查,发现ALT 和AST水平并未增加且小鼠肝脏组织学检查未显示肝细胞肿胀和坏死,证实ΔUA-GlcNS可能作为HGF诱导剂抑制肝损伤。

肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化是肝纤维发生、发展的核心环节,活化的HSCs是纤维化肝脏中细胞外基质的主要来源细胞。表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)家族可活化HSCs和促进HSCs向肌成纤维细胞转化,在肝纤维化形成过程中发挥重要作用。肝素结合性表皮生长因子(heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor,HB-EGF)是EGF家族代表性成员之一,主要存在于肝脏非实质细胞中,在受损肝脏中表达增加,通过增强EGF受体磷酸化和ErbB4受体合成促进HSCs活化和抑制HSCs凋亡[21],导致肝纤维化程度加重。Guo等[22]通过对HB-EGF转基因小鼠注射CCl4构建肝纤维化模型,后从模型小鼠中分离HSCs进行体外研究,检测到HB-EGF转基因小鼠α-平滑肌肌动蛋白和胶原蛋白-I表达较野生型小鼠明显增强,伴随更为严重的纤维化,证实过度表达HB-EGF基因可导致HSCs活化增加和凋亡减少,抑制HB-EGF,有望成为抗肝纤维化治疗的潜在靶点。但是,Huang等[23]通过研究HB-EGF基因敲除小鼠发现,来自HB-EGF-/-小鼠的活化HSCs中α-平滑肌肌动蛋白和胶原蛋白mRNA表达更高,伴随肝脏纤维化程度加重;外源性HB-EGF可抑制HSCs活化和胶原生成。故此,提出HB-EGF可作为抗纤维化天然因子。与此相一致,在硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)诱导的小鼠肝纤维化模型中,HB-EGF敲除后其肝纤维化程度较野生型小鼠明显加重。业已证实,临床肝纤维化患者组织样本中HB-EGF表达水平增高,这有利于受损肝组织的修复[24]。人类临床肝纤维化样本与过表达HB-EGF之间的分子生物学相关性或许更强,提示HB-EGF 更可能增强肝脏纤维化。因HB-EGF中肝素结合结构域与肝素有较强的亲和性,所以与EGF受体的结合是EGF的数十倍,推测添加肝素与HB-EGF结合后可抑制其对HSCs活化的促进作用。

三、肝素抑制肝癌细胞增殖、侵袭与扩散

细胞增殖、血管生成和免疫逃逸的相互作用促进肿瘤的发生发展,基于此三项机制的靶点治疗也越来越引起专业学者的关注。研究发现,肝素作为一种可生物降解的多糖,在肿瘤血管生成[25]及肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移等过程均发挥抑制作用[26]。Wang等[27]通过修饰肝素分子结构增强其生物活性同时降低出血风险,继而用作抗肿瘤治疗中递送药物的纳米载体,结果发现由肝素纳米颗粒递送的药物在进入机体后药物毒性明显降低。截止目前,已经开发出多项基于肝素的给药系统,例如,胞苷-磷酸-鸟嘌呤寡核苷酸作为TLR9的免疫激活剂,可加强辅助性T细胞介导的免疫反应[12];藤黄酸作为一种天然抗肿瘤活性物质,对HCC具有良好的杀伤作用。Shao等[28]通过整合肝素和以上两种物质,有效地结合了肝素抗肿瘤血管形成、藤黄酸化疗作用和胞苷-磷酸-鸟嘌呤寡核苷酸免疫治疗作用。由动物实验证实,这种策略还显著延长HCC小鼠的生存时间。HCC患者肿瘤组织中肝素酶(heparinase,HPSE)表达水平明显上调,作为一种多功能细胞外水解酶,HPSE可激活HPSE/SDC-1/TNF-α轴和p38mapk通路,诱导微血管内皮细胞坏死,促使HCC细胞的侵袭和转移[29]。肝素是HPSE的水解底物,可下调HPSE表达[30],发挥抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的作用。HGF/c-Met参与肝癌细胞增殖、迁移和血管生成[31],肝素通过干扰HGF,抑制c-Met信号激活,进而抑制HGF/c-Met介导的HCC细胞侵袭和迁移,发挥抗HCC作用[19]。除此之外,Gunes等[32]在大鼠HCC细胞系中行cDNA 微阵列分析测定硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)基因表达水平,研究肝素对这一肿瘤抑制基因表达的影响,证实过表达TXNIP使肝癌细胞黏附性和增殖性降低,肝素通过与TXNIP启动子上的独特碳水化合物反应元件结合,加速TXNIP转录进程;在此背景下,通过使用HCC大鼠模型检测肝素对TXNIP表达的体内效应,发现肝脏中TXNIP表达增加,体内研究证实肝素可降低肝癌细胞黏附性和增殖性。肝素在细胞生长、分化、迁移和侵袭中起重要作用,但其介导的肿瘤细胞行为及其分子机制尚未统一。拓扑替康(topotecan,TpT)作为拓扑异构酶Ⅰ的主要抑制化合物,可一定程度上增强肝癌细胞同质性黏附作用,抑制肝癌细胞转移;还可下调肝癌细胞黏附于异种组织细胞的能力,使得肿瘤细胞不易定植于其他组织而形成转移灶[33]。Dudás等[34]从肝癌组织中选择具有高拓扑异构酶I活性的HepG2细胞系和具有低拓扑异构酶I活性的Hep3B细胞系,经肝素处理测量这些提取物的酶活性,发现肝素暴露后消除了Hep3B细胞系的酶活性,而HepG2细胞系保留了其酶活性。由于TpT的疗效取决于拓扑异构酶I的实际活性,若同时给药,肝素虽然会干扰TpT对低酶活性肝癌细胞的生长抑制作用,但是证实肝素能使拓扑异构酶Ⅰ活性低的正常周围组织免受TpT的细胞毒作用。因此,TpT治疗高拓扑异构酶I活性的肝恶性肿瘤时,或可联合应用肝素,降低化疗药物的副作用。

部分肝素样物质在HCC诊断及治疗中发挥的作用不容忽视,其与肝素的相关性值得进一步研究。Nakamura等[35]发现HCV核心蛋白通过促进HB-EGF自分泌,参与Ras/PI3 Kinase-Akt信号通路激活Akt,进而刺激癌细胞增殖。Wang等[36]发现转录抑制因子甲基CpG结合蛋白-2通过HB-EGF/EGFR通路促进同源盒基因HOXD3(调控细胞增殖和分化重要分子,参与肿瘤多种生物学过程)的表达,从而诱导HCC 的迁移、侵袭和血管生成。因此以HB-EGF为靶点抑制HCC肿瘤细胞增殖,可成为抗肿瘤治疗思路与前景之一。中期因子(midkine,MDK)是一种肝素结合性生长因子,肝素分子中GAG侧链可抑制MDK发挥其活性[37],进而诱导细胞凋亡并抑制肿瘤生长和转移[38]。目前MDK的应用已处于临床前开发阶段,MDK单独或联合AFP可显著提高HCC的诊断准确性,有望在HCC早期诊断、治疗及预后分析中发挥价值。

四、结语

综上所述,肝素参与病毒性肝炎、肝纤维化、肝细胞癌的发病机制,并潜在一定临床应用价值,但目前多数研究尚限于体外和药理学研究、病例报告和小样本回顾性队列研究,缺乏国内外指南及专家共识的统一推荐意见,这也可能与肝素在肝病患者应用时潜在出血风险有关。然而,肝病患者凝血功能障碍是一种低水平的再平衡状态,通过准确、动态地评估个体出凝血风险与不良事件发生的可能性,制定个体化管理策略,有望使肝素这一经典药物在非抗凝方面发挥其最大应用价值。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。