外泌体治疗股骨头坏死的研究进展

王 岩，马剑雄 董本超，杨培川，李 岩，周丽芸，孙 磊，靳洪震，卢 斌，田爱现，王 颖，柏豪豪，马信龙

股骨头坏死（osteonecrosis of femoral head，ONFH）是骨科临床上常见的疾病，多发生于中青年患者，发病机制尚未明确且致残率较高，严重影响患者的健康和生活。虽然关节置换等日趋成熟的手术技术帮助广大ONFH 患者提高了功能恢复质量，但是如何治疗早期ONFH 并预防疾病进展，从而延缓关节置换的时间仍然困扰着广大学者[1-3]。目前广泛应用的保髋手术主要包括髓芯减压法[4]、髓芯减压联合带血管蒂[5]或不带血管蒂的骨块移植[6]、髓芯减压联合多孔材料支撑[7]、干细胞移植术[8]、截骨术[9]等几大类。但是这些方法的临床疗效不统一，仍然有很大一部分ONFH 会发展成股骨头塌陷，最终导致髋关节功能丧失，而不得不进行关节置换术。关节置换术的费用昂贵且存在不少并发症，例如感染、假体松动与脱位以及假体周围骨折等，给患者及社会带来沉重的负担[3-4]。因此，早期诊断并选择合适的保髋治疗手段对ONFH 患者来说非常关键，能够在临床上减轻ONFH 给患者带来的痛苦和伤害，造福百姓[5-6]。细胞治疗由于其具有高效修复作用也逐渐成为促进骨组织再生的常用方法，而其中分化能力较强的干细胞无疑是首选，然而直接使用干细胞进行干预仍存在免疫排斥、血栓形成等问题[7]。近期研究发现，外泌体具备其分泌来源干细胞的一些功能，同时能避免干细胞疗法的多数风险，有良好的促进组织修复再生的应用前景，为ONFH 的治疗打开了全新的局面[8]。本文综述了当前外泌体在治疗ONFH 领域的研究现状和进展，为临床中ONFH 的治疗提供新思路和新方法。

1 ONFH

ONFH 作为一种进行性疾病在临床中实质上是一个病理演变过程，坏死部位初始一般发生在股骨头的负重区，股骨头内骨小梁开始发生损伤，空间结构在非正常应力的作用下开始出现异常，随即骨小梁组织开始针对损伤进行修复，与此同时损伤和修复反复交替进行，当损伤大于修复时，最终导致整个股骨头的坏死和塌陷。ONFH 在骨科疾病中是一类致残率较高的常见病，Mont 等[10]的研究表明，未来10 年内全球ONFH 患者的总数仍会逐年增高。据统计，目前国内ONFH 的患者数量大约达到了750 万，与此同时每年还会新增大量病例，其数量高达30 万～40 万左右，给我们的社会和经济造成了很大的负担，是目前世界骨科疾病领域非常棘手的难题之一[11]。国内ONFH 流行病学显示，我国ONFH 最常发生在40 岁以后的人群中，其中男性患者的发病时间比女性患者更早一些，且男性患者的数量约为女性患者的2 倍[12]。

当前的研究将ONFH 的发病因素大致分为创伤性和非创伤性两种类型，创伤性因素主要包括由于外伤引起的股骨颈骨折和髋关节脱位等；非创伤性因素主要包括糖皮质激素的过量使用、酗酒及一些免疫性疾病合并引起的ONFH[13]。目前来看国内非创伤性ONFH 的发病率非常高且呈逐年递增的趋势，流行病学统计结果显示，非创伤性ONFH 大致占该疾病总患病人数的70%左右[14]。实际上，从ONFH 的本质上来看，主要是由于股骨头周围出现血供受阻以及生物力学环境改变等问题，从而引起股骨头内骨代谢出现异常，最终导致股骨头出现坏死和塌陷。这些过程可能是创伤、术后复位不良、糖皮质激素、饮酒、血液发育障碍以及一些其他因素导致的结果[5]。

关于ONFH 的发病机制众说纷纭，现有研究成果表明ONFH 可能与以下几个方面有关：包括骨细胞凋亡学说[15-16]、血液凝滞学说[17]、脂质代谢紊乱学说[18-19]、骨质疏松学说[18]等，但目前没有一种理想且明确的假说来完全解释ONFH 的发生和发展，导致在临床诊疗过程中处理该疾病的不确定因素增多，严重影响临床上的疗效[20]。虽然当前相关医学领域对ONFH 的病因、发病机制、诊断以及治疗等方面均进行了大量的研究，但是对其确切的起源和机制尚没有出现明确的共识。就目前的研究现状来看，ONFH 其实不仅仅是由一种致病因素所导致的疾病发生，而是由很多复杂因素联合作用所导致的最终结果[13]。

迄今为止，临床上对于早期ONFH 的治疗尚无有效且理想的手段，而且该疾病发展进程往往难以逆转，大部分患者到晚期后将不可避免地出现股骨头坏死和进一步塌陷，甚至出现髋关节的骨性关节炎，累及整个髋部，严重影响患者活动，到这种程度后，通常只能采取髋关节置换的治疗方式来应对，而关节置换的费用昂贵且存在不少并发症，这些问题将会同时给患者和社会带来沉重的打击与负担[21]。因此，探讨ONFH 的早期非手术治疗方案始终作为骨科疾病领域的重点及难点，被广泛探索和研究[22-23]。

2 外泌体

近年来，细胞治疗在治疗多种难治性疾病中的潜力被逐渐挖掘，例如治疗晚期肝硬化、ONFH、恶性肿瘤、心肌梗死等。从多种组织中（包括骨髓、滑膜、滑液等）提取的间充质干细胞具有顽强的生命力及较高的多向分化潜能（成软骨、骨、肌肉、脂肪分化等）[24]。但直接使用细胞进行治疗仍具有一定缺陷，例如移植细胞会导致免疫排异反应、栓塞等[25]。因此，需要找到一种新的治疗方法，使其具有细胞治疗的优点，但同时能避免细胞移植所带来的风险。近来大量研究表明，细胞治疗主要是通过旁分泌机制来提高损伤部位周围原有细胞的活性，而不是简单的向特定实质细胞分化并修复受损组织。后续研究发现在旁分泌机制中，外泌体发挥了重要的作用。外泌体最早是在1980 年由Eberhard G.Trams和R.M.Johnstone 发现并命名。外泌体是由来源于细胞内的多泡体与细胞膜融合而形成的，是一种直径小于150 nm 的囊泡，其在细胞间通讯中发挥着重要的作用[26]。外泌体的膜蛋白在靶向结合过程中有着重要的作用，内含物主要为蛋白质和RNA。随着研究的不断深入，发现外泌体功能多样，其可参与到机体免疫应答、抗原递呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方面的信号交流。外泌体来源丰富，机体的组织、体液、细胞间都有外泌体的存在。目前分离外泌体的方法主要包括超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、免疫磁珠抗体捕获法、凝胶层析法、商用试剂盒法等。目前研究认为，外泌体具有很强的修复功能，与机体的新陈代谢、组织修复、免疫调节、肿瘤的发生和发展等密切相关，并减少了诸如血管栓塞、免疫排异等不良反应[27-28]。其中，间充质干细胞来源的外泌体具备其分泌来源干细胞的一些功能，同时能避免干细胞疗法存在的多数风险，具有良好的促进组织修复再生的应用前景。

外泌体来源丰富，机体的组织、体液、细胞间都有外泌体的存在。不同细胞来源的外泌体表现出异质性特征和成分。人们发现间充质干细胞（MSCs）广泛分布于骨髓、脂肪组织、脐带、羊水等全身，在骨代谢、血管生成、免疫调节等方面发挥着不可或缺的作用[29]。由于MSCs 的多向分化潜能，包括成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，MSCs 移植已广泛应用于再生医学[30]。目前用于骨再生与修复研究的干细胞主要来源包括脐血间充质干细胞（ucMSCs）、脂肪间充质干细胞（ADSCs） 和骨髓间充质干细胞（BMSCs）。研究证实，脐血来源的ucMSCs 具有较弱的成骨分化能力。ADSCs 是一种有前景的间充质干细胞分泌的外泌体（MSC-Exos），可用于骨再生的来源。而BMSCs 是成骨细胞的主要来源，具有显著的成骨分化能力。研究表明，BMSCs 比ADSCs 对成骨诱导培养条件更敏感。与ADSCs 相比，BMSCs 具有更强的成骨诱导能力[31]。因此，从BMSCs 中提取外泌体用于骨再生修复更为合理。

3 外泌体在ONFH 领域的应用

ONFH 是一类复杂的骨科疾病，无论是在早期诊断还是治疗过程中，均面临着一些关键共性难题。其中早期ONFH 只能通过MRI 扫描来确定诊断，费用昂贵且不方便。寻找一种经济方便的方法筛选ONFH 十分重要。经初步筛查后，可再使用MRI 进行扫描进一步确诊。循环外泌体代表了多种疾病新的生物标志物。针对循环外泌体水平是否可以作为ONFH 的诊断生物标志物，学者进行了相关研究。Zhu 等[32]研究首次报道了类固醇诱导的ONFH 患者的循环外泌体水平显著低于健康人群。

而在治疗方面，近期研究证据显示，干细胞来源的外泌体可以增强成骨细胞样细胞和血管内皮细胞的活性，减轻大鼠骨缺损模型的缺损面积，说明其可以促进骨再生，并增强血管生成[33]。另外，相关研究进一步证实了外泌体可以有效地减少软骨细胞中炎性细胞因子的产生，并最终增强软骨组织的再生，从而治疗骨性关节炎[34]。在ONFH 领域，来自人类滑膜来源的干细胞分泌的外泌体可以通过增强增殖和抗凋亡作来预防糖皮质激素诱导的大鼠ONFH，且人类诱导的多能干细胞衍生的外泌体可以通过促进血管生成来预防ONFH[19-20]。这种外泌体治疗在再生治疗中发挥着越来越重要的作用。然而，与药物治疗不同的是，BMSCs 是位点调控的，可根据局部微环境分泌不同浓度的生物活性因子和信号[35]。因此，BMSCs 来源的外泌体能否完全替代外泌体发挥其治疗作用还有待进一步研究。此外，还应考虑使用外泌体的潜在风险。越来越多的证据表明，细胞通过释放和递送microRNAs 到肿瘤释放外泌体中进行交流[36]。也有报道称，外泌体载体可以转移与神经退行性疾病相关的毒性蛋白[37]。因此，使用BMSCs 来源外泌体的安全性也需要进一步评估。所以，在外泌体治疗应用于临床之前，还需要进行深入地研究，包括标准化生产、外泌体表征、改进分离、产量优化、可重复性、效力测定方法的开发以及特定临床适应证的剂量确定等，都需要进一步深入探讨。

由于股骨头坏死病因不同，来源不同的外泌体发挥的作用也不相同。对于激素性股骨头坏死来说，BMSCs 来源的外泌体可以上调与骨修复有关的生长因子、骨形态发生蛋白、转录生长因子等，从而诱导BMSCs 向骨分化。来自富含血小板血浆的外泌体对糖皮质激素内质网应激诱导的细胞凋亡具有抗凋亡作用[38-39]；对于创伤性股骨头坏死来说，有研究认为BMSCs 来源的外泌体中较低的miR-224-3p水平促进创伤性ONFH 的血管生成[40-41]。然而对于非创伤性股骨头坏死组织，CD41 缺失外泌体损害MSCs 的成骨分化和迁移[42]。

此外，目前在骨科领域，有关外泌体治疗相关骨科疾病的研究相对较少，尤其在ONFH 的治疗研究中，且其作用机制尚未完全明确。最近有研究发现，使用基因工程等技术对外泌体进行修饰或功能化可以达到更好的治疗效果[21]。因此，基于当前国内外研究现状，探索一种修饰干细胞来源外泌体的方法和手段，使其能够具有治疗ONFH 的生物功能，在ONFH 的早期干预治疗研究中是一个亟待探索的全新领域。

4 总结与展望

目前ONFH 发病率呈逐年增高趋势，是国内外关注的热点和重点。但因其致病机制仍未明确，目前临床上尚无有效的早期治疗方式，患者晚期通常只能进行髋关节置换手术。但关节置换的费用昂贵，且后期不可避免地会出现一些并发症，给患者带来沉重的身心伤害和经济负担。因此，迫于临床需求，探讨ONFH 的早期非手术治疗方案一直是骨科研究领域的难点和热点。细胞治疗具有高效修复作用，逐渐成为促进骨组织再生的常用方法，其中分化能力较强的干细胞无疑是首选，然而直接使用干细胞进行干预仍存在免疫排斥、血栓形成等瓶颈。外泌体具备其分泌来源干细胞的一些功能，同时能避免干细胞疗法的多数风险，为ONFH 的治疗打开了全新的局面。虽然目前此领域已有相关研究显示其具有一定的效果，但是距离临床使用和推广仍有很长一段路需要探索。