三七花治疗阿尔兹海默病的网络药理学分析及分子对接

胡 靖，郭 琰，马雅鸽，赵声兰

（云南中医药大学，云南 昆明 650500）

阿尔兹海默病（Alzheimer's disease，AD），是一种中枢神经系统退行性疾病，临床特征为学习记忆障碍和认知功能减退[1]。阿尔茨海默病是老年人最为常见的一种痴呆类型，也是老年人最常见的慢性疾病之一，因而，又被称为老年痴呆。AD发病机制包括β淀粉样蛋白的沉积[2]、tau蛋白异常过度磷酸化[3-4]、胆碱能损伤、兴奋性氨基酸毒性和免疫炎症反应等[5-7]。目前，有胆碱酯酶抑制剂以及非竞争性N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂（美金刚），但仍无理想的临床新型抗阿尔茨海默病药物[8]。近年来的相关研究表明，传统中药三七（Notoginseng Flos）对治疗阿尔兹海默病具有良好的疗效。孙天赐等[9]基于系统生物学的角度对三七防治AD的作用机理进行研究；钟振国等[10]以D-半乳糖腹腔注射致亚急性损伤合并鹅膏蕈氨酸损毁双侧大脑Meynert基底核建立AD大鼠动物模型，使用三七总皂苷进行治疗，发现三七总皂苷对AD大鼠模型大脑胆碱能神经的病理损害具有保护作用；范亚军等[11]利用蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸（OA）模拟AD病细胞损伤模型，研究表明三七总皂苷对OA引起的神经细胞凋亡具有一定的保护作用。三七花是否具有治疗阿尔兹海默病的效果，尚未见有报道，本文利用网络药理学及分子对接技术对三七花治疗阿尔兹海默病的物质基础以及潜在的作用机制进行探索和预测分析研究，以期为三七花防治老年痴呆提供理论依据。

1 数据来源及分析方法

1.1 三七花活性成分及作用靶点的收集 利用中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine database and analysis platform，TCMSP），（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）输入关键词“三七花”检索。口服生物利用度是药物筛选的关键参数[12]，因为三七花在日常生活中大多以饮品来使用，故选择口服生物利用度作为筛选关键参数，根据口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥15%进行筛选[13]，得到三七花的主要化学成分，并匹配相应的作用靶点。

1.2 疾病靶点收集 利用DisGeNET数据库（疾病基因数据库，http：//www.disgenet.org/） 和 GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/），以“Alzheimer's disease”为关键词检索阿尔兹海默病相关靶点，将2个数据库的靶点进行归并得到与阿尔兹海默病相关的基因和靶蛋白信息。

1.3 三七花化合物-靶点的网络构建 将三七花活性成分对应的靶点和阿尔兹海默病相关的靶点进行比较，获得二者共有的靶点，然后使用Cytoscape 8.0图形化网络分析和编辑软件，进行“三七花活性化合物-疾病靶点”的网络构建，网络中的节点表示三七花活性成分、疾病相关靶点，网络中的边用来连接药物与活性成分、活性成分与关键靶点，疾病与关键靶点；网络中一个节点的度表示和节点相连的条数，度值越大说明这个节点越可能是关键节点[14]。

1.4 GO功能富集和KEGG信号通路分析 利用Metascape数据库对三七花改善阿尔兹海默病的靶点进行GO功能富集和KEGG通路分析，将所交集后的基因靶点名输入Multiple Gene List，上传后选择“H.sapiens”进行个性化分析，点击Enrichment选择通路进行分析。

1.5 蛋白互做网络的构建 STRING是搜索已知蛋白和未知蛋白相互作用的数据库，为了阐述三七花改善阿尔兹海默病的相互作用关系，将1.3得到三七花改善阿尔兹海默病靶点输入STRING数据库，物种选择“human”，该数据库可以对蛋白质的相互作用关系进行打分，分值越高表明相互作用的置信度越高[15]，本文将相互作用评分设置为中置信度（0.400），得到三七花改善阿尔兹海默病的相互作用关系图（PPI）。

1.6 分子对接 为了确定网络药理学预测三七花改善记忆靶点的准确性，采用分子对接技术进行验证。将蛋白互作网络中评分较高的蛋白与KEGG结果中靠前的通路进行比较分析，得到准备验证的关键靶点，将靶点输入PDB数据库，选择最佳的蛋白晶体结构，并从PubChem数据库中下载三七花化学成分2D结构式，通过chem3D软件将其优化，将关键靶点的蛋白结构、三七花主要成分结构式导入到AutoDock－Tools在线平台进行分子对接前处理，之后使用命令提示符进行对接，预测潜在蛋白质的结合位点，使用Vinascore软件对其打分，查看其分子对接的亲和力，用PyMOL软件进行分子对接并作图。

2 结果与分析

2.1 三七花活性成分及其潜在作用靶点筛选结果从中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）通过OB≥15%筛选得到三七花化学成分共38种，其中血脑屏障透过率（BBB）较好的有beta-bourbonene（β-波旁烯）、alpha-cubebene（Alpha-荜澄茄油烯）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）等成分。血脑屏障透过率较低的可通过修饰和剂型选择加以提高。通过中药系统药理学分析平台（TCMSP）得到上述已知三七花38种成分中有作用靶点的成分25个，使用uniprot数据库匹配相应的作用靶点，得到64个作用靶点（见表1）。

2.2 疾病相关的靶点 利用DisGeNET数据库，以“Alzheimer's disease”为关键词检索阿尔兹海默病相关靶点，获取到已知与阿尔兹海默病相关的基因和靶蛋白信息123个。同时利用GeneCards数据库，以“Alzheimer's disease”为关键词检索阿尔兹海默病相关靶点，以score大于1为条件筛选，获取到已知与阿尔兹海默病相关的基因和靶蛋白信息有3 508个。

2.3 三七花活性成分作用靶点-疾病靶点的交集 将三七花活性成分对应的作用靶点和疾病相关的靶点进行交集，交集后的得到交集靶点34个（如表2所示）。

表2 三七花活性成分与老年痴呆疾病的交集靶点

2.4 三七花活性成分-疾病靶点网络构建 构建“中药化合物-疾病靶点”网络[16]，如图1。网络中共有3部分内容，红色为通过TCMSP数据库筛选出来的活性成分25个，其中与疾病靶点相交的成分有23个；蓝色为阿尔兹海默病；绿色为活性成分作用靶点与疾病相关靶点相交互的靶点34个，分别是CHRM1、CHRM2、PTGS2、ADRB2、SLC6A4、PTGS1、RELA、IL10、CALM1、MAOB、HTR3A、SLC6A2、ADRA1A、BAX、EIF6、TP53、CCNB1、RHOA、BCL2、SLC6A3、ADH1C、ADH1A、PIK3CG、HTR2A、OPRM1、TNF、CASP9、JUN、IL6、CASP8、PON1、CASP3、MAP2、BCHE。通过Cytoscape计算网络参数，得到三七花活性成分和靶点作用关系[17]。三七花中化学成分按节点度值排序由高到低依次是 β-谷甾醇（19）、β-榄香烯（12）、β-石竹烯（9）、（-）-异香木兰烯（8）、β-桂烯（8）、西多糖苷（7）、棕榈酸甲酯（7）、β-波旁烯（6）、冰片（6）、β-立方体蛋白（5）、（1R，4aR，8aS）-1-异丙基-7-甲基-4-亚甲基-2，3，4a，5，6，8a-六氢-1H-萘（5）、EEE（4）、荜澄茄油烯（4）、糠醇（3）、T-依兰油烯（3）、糠醛（3）、苯乙醛（3）、（1R）-（+）-樟脑（3）、α-古芸烯（3）、正庚烷（2）、甲酸混酯（2）、辛酸乙酯（2）、甲酸丙酯（2）。这些化学成分被诸多学者认为可能是改善阿尔兹海默病的物质基础。

图1 三七花活性成分-疾病靶点网络

同时节点度值较高的靶点是CHRM1（毒蕈碱乙酰胆碱受体M1）、CHRM2（毒蕈碱乙酰胆碱受体M2）、PTGS2（前列腺素 G/H 合成酶 2）、PTGS1（前列腺素G/H合成酶1）、ADH1C（醇类脱氢酶1C）等。详细参数见图2。

图2 靶点节点度值

2.5 GO和KEGG富集分析 用Metascape数据库对三七花改善阿尔兹海默病的靶点进行GO功能富集和 KEGG通路分析，得到图3，GO分析得到的主要通路为对异物刺激的反应（response to xenobiotic stimulus）、细胞对有机环状化合物的反应（cellular respose to organic cyclic compound）、对糖皮质激素的反应（response to glucocorticoid）、对无机物的反应（response to inorganic substance）、离子运输的调节（regulation of ion transport）、调节神经元的凋亡过程（regulation of neuron apoptotic process）、膜筏（membrane raft）以及蛋白质磷酸化的正向调节（positive regulation of protein phosphorylation） 等；KEGG 富集主要通路为脂质和动脉硬化（lipid and atherosclerosis）、C型凝集素受体信号传导途径（C-type lectin receptor signaling pathway）、5-羟色胺突触（serotonergic synapse）以及神经营养剂（neurotrophin signaling pathway）等。详细参数见表3。

图3 图a为GO分析，图b为KEGG富集分析

表3 GO分析与KEGG富集分析参数

2.6 PPI网络的构建及核心基因分析 将三七花改善阿尔兹海默病的靶点输入到String数据库进行分析，获得靶点蛋白相互作用关系网络图（见图4），共有34个节点和132条相互作用连线，节点平均数为7.76。将图导入Cytoscape，依据网络节点度值排序，得到前五个关键靶点蛋白依次为IL6（白介素-6）、TNF（肿瘤坏死因子）、CASP3（钙化酶-3）、TP53（细胞肿瘤抗原P53）、PTGS2（前列腺素G/H合成酶和环氧酶2）。由PPI图4可知这些关系来自3大类：已知交互，预测的相互作用以及其它。已知交互多来自于数据库和实验证明，预测的相互作用来自基因共同产生，其他来自于文本挖掘。

图4 三七花改善阿尔兹海默病靶蛋白互做（PPI）网络图

2.7 分子对接 蛋白互作网络（PPI）中评分较高的蛋白可以认为起到重要作用，将评分较高的潜在蛋白相对应的靶点与KEGG通路分析结果进行比较分析，将三七花改善阿尔兹海默病的潜在靶点PTGS2（前列腺素G/H合酶2）和CHRM2（毒蕈碱乙酰胆碱受体M2）作为分子对接的对象，导入PDB数据库，通过数据库自带排练方式，得分由高到低选择，得到PTGS2、BCL2分辨率较高的蛋白结构5f19、5yc8。在“活性成分–疾病靶点”中选择度值较高的三七花活性成分，西多糖苷（sitogluside）、β-谷甾醇（betasitosterol）作为对接分子，在AutoDockTools在线平台处理配体和受体，并得到运行参数，通过命令提示符进行对接处理，得到Vinascore得分分别为-7.3和-7.7。之后在PyMOL软件上将处理好的配体和受体对接，得到图5。Vina是以相应的口袋参数对受体和配体进行分子对接所得到复合物的得分，这个值越低代表受体和配体亲和力越高，对接结果越好。结果发现筛选得到的活性成分与预测的靶点均有结合。其中西多糖苷（sitogluside）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）与PTGS2、CHRM2靶点有较强的亲和力。

图5 活性成分与靶点蛋白的分子对接

3 讨论

中医是我国的国粹，老年人对中药有较高的信任度，近年来关于中药用于改善痴呆患者症状的研究日益增多，目前主要为活血化瘀、改善循环类药物。中药个体化方案灵活性高，患者依从性较好，但目前缺乏临床随机双盲试验，且样本量较小，有不同程度的毒副作用，故中药多为辅助用药。乔森等[18]研究认为，血管相关病变是AD的重要原因，血瘀既是病理产物又是致病因素，从“瘀”进行治疗，取得不错的临床效果。三七花性甘凉，具有清热平肝、生津止渴、活血化瘀等功效，适用于头晕、目眩、耳鸣等症[19]。叶长青等[20]通过网络药理学及分子对接技术，发现西多糖苷（sitogluside）与靶点PTGS2结合较好，可能是治疗AD的关键。同时大量网络药理学发现，β-谷甾醇[21-23]是治疗AD的关键成分。

本研究采用网络药理学的方法，筛选出23个三七花活性成分交集到34个AD靶点，通过Cytoscape 8.0软件构建“活性成分-靶点”关联网络，对关键靶点进行GO功能富集和KEGG通路分析表明，主要通过西多糖苷（sitogluside）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、β-榄香烯等活性成分调控 CHRM1、CHRM2、PTGS2等AD靶点。分子对接表明三七花的活性成分西多糖苷（sitogluside）[20]、β-谷甾醇（beta-sitosterol）[20-21]与老年痴呆的PTGS2、CHRM2等靶点有较强的结合，为三七花防治AD的提供了理论基础。