浆液性卵巢癌患者的斯钙素2表达水平及其与预后的关系

吴文娟，陈历排，张东辉，高春辉

广州医科大学附属肿瘤医院妇科肿瘤外科1、病理科2、重症医学科3，广东 广州 510095

根据2020年癌症统计，全世界每年约有313 959例卵巢癌新发病例和207 252 例卵巢癌相关的死亡病例[1]。卵巢上皮性肿瘤为最常见的卵巢肿瘤，多数确诊时已是晚期，转移及复发率高，因此卵巢癌治疗仍存在巨大挑战[2]。斯钙素2 (Stanniocalcin 2，STC2)属于高度保守的分泌型糖蛋白激素家族。人类的STC2是由302个氨基酸组成，广泛表达于肾、卵巢、骨、神经及肌肉等组织中，并具有广泛的促瘤作用[3]。本文基于公共数据库TCGA及GTEx的转录组数据，对STC2在泛癌中的差异表达、预后意义进行了分析，进而在高级别浆液性卵巢癌及正常卵巢组织中，采用免疫组化检测STC2的表达，并且分析STC2的表达水平与患者预后的相关性，为后续的分子及机制的研究提供临床基础。

1 材料与方法

1.1 泛癌中的STC2 数据来源于TCGA (The Cancer Genome Atlas，癌症基因组图谱)及GTEx(Genotype Tissue Expression)数据库中level3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq 数据，将其转成TPM 格式并进行log2转化。统计分析及可视化主要使用的是R(3.6.3版本)软件的ggplot2(3.3.3 版本)。本文分析了STC2 在TCGA 的肿瘤组织及对应的GTEx 正常组织中的差异表达。Tumor Immune Estimation Resource(TIMER，http://timer.comp-genomics.org/)可用于分析泛癌中的免疫浸润情况，包括TCGA数据中的32种癌症10 897例样本的基因表达、临床预后、体系突变、体细胞拷贝数的改变以及肿瘤免疫系统的特征[4]。采用TIMER 2.0在线分析了STC2 在泛癌中的免疫浸润情况。基于TCGA 的临床信息，分组为0～50vs50～100，使用R 语言的survival 包(3.2～10 版本)用于生存资料的统计分析；survminer 包(0.4.9 版本)用于可视化。分析STC2在泛癌中的预后意义。

1.2 材料与主要试剂 收集2012 年1 月至2019年5月在广州医科大学附属肿瘤医院妇瘤科手术并经病理确诊为浆液性卵巢癌的102例患者的卵巢肿瘤组织，以及2011年3月至2019年7月因非卵巢部位良性病变行卵巢切除的26 例正常卵巢组织。标本离体后经石蜡包埋固定保存。所有患者术前均签署知情同意书并获得广州医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准。术后根据病理结果接受化疗、靶向治疗等规范治疗。STC2 抗体购自abcam(ab262857)，使用安捷伦公司的Dako Omnis 全自动免疫组化仪进行免疫组织化学染色，显色试剂使用DAKO GV800。

1.3 免疫组化测定 采用免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)检测STC2 在浆液性卵巢癌及正常卵巢组织中的表达。所有待测样本经石蜡包埋固定连续切片备用，切片厚度为3 μm，经HE染色确诊为腺癌后进行常规免疫组化染色。各步骤严格遵照试剂盒说明书进行操作。具体方法：使用免疫组化专用防脱玻片，60℃烘烤1 h，上机；脱蜡2 min；抗原修复，使用tris-EDTA(PH9.0)抗原修复液进行标本抗原修复，条件为97℃、30 min；修复完毕的切片在染色单元进行全自动染色，一抗孵育条件为32℃、30 min，HRP 标记的多聚物二抗孵育20 min，DAB 显色反应5 min，苏木素衬染5 min。染色完毕的切片进行脱水干燥，使用环保封片剂封片，镜下观察。结果由至少两名病理科医生判读：染色的评分主要考虑着色强度及阳性细胞的百分率，着色强度分为无色(0 分)、淡棕色(1 分)、棕黄色(2 分)、棕褐色(3 分)；阳性细胞百分率：＜25% (1 分)，26%～50% (2 分)，51%～75% (3 分)，＞75%(4 分)，两者得分相乘，＞4 分判定为高表达，否则为低表达。

1.4 随访 根据患者病历上登记的联系方式，使用电话或者门诊进行随访，随访开始时间为手术时间，随访结束时间为随访截止时间或术后死亡时间，随访时间截止至2019 年7 月16 日。无进展生存时间(progression free survival time，PFS)指手术时间至首次复发或转移时间或随访截止时间。总生存时间(overall survival，OS)指手术时间至全因死亡时间或随访截止时间。

1.5 统计学方法 基于公共数据库的差异表达分析，数据来源于UCSC XENA (https://xenabrowser.net/datapages/)经Toil流程[5]统一处理的TCGA和GTEx的TPM 格式RNAseq 数据。计数资料使用频数(百分率)表示，比较STC2 在浆液性卵巢癌及正常对照组中的表达采用χ2检验或Fisher's 精确检验。差异基因表达分析时两组间的差异比较，若满足正态性检验，方差齐选用独立样本T检验，方差不齐选用Weltch t'test；若不满足正态性检验使用Mann-WhitneyU检验。Kaplan-Meier 生存曲线用于预后分析，组间比较采用Log-rank检验。预后分析采用COX回归模块。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 STC2 在泛癌中的表达差异 基于STC2 在TCGA 及GTEx 数据库中的表达差异分析显示，STC2在多种癌种中存在差异表达，如图1 所示，与正常对照组比较，STC2在肾上腺皮质癌、胆管癌、结肠癌、肾透明细胞癌、卵巢癌等24 个癌种中均高表达，在胰腺癌、肾乳头状细胞癌、肺腺癌、甲状腺癌等6 个癌种中均低表达。

图1 STC2在泛癌中的表达差异Figure 1 Differential expression of STC2 in Pan-cancer

2.2 STC2 在泛癌中的预后价值 STC2 在泛癌中的预后分析提示，在肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、宫颈癌、结肠癌等21个癌种(图2展示了20个癌种)中，STC2表达的高低与患者的预后相关，除在肾透明细胞癌中，在其余的20 个癌种中STC2 表达高的患者预后更差。

图2 STC2在泛癌中的预后价值Figure 2 Prognostic value of STC2 in Pan-cancer

2.3 泛癌中STC2 与免疫浸润的相关性 STC2在泛癌中的表达水平与免疫浸润的相关性分析显示，在妇科肿瘤如卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌，消化道肿瘤如肝癌、食管癌、胃癌、直肠癌以及呼吸道肿瘤如肺腺癌及鳞癌等21个癌种中STC2的表达与肿瘤的免疫浸润相关(图3)。

图3 泛癌中STC2与免疫浸润的相关性Figure 3 Correlation between STC2 and immune invasion in Pan-caner

2.4 STC2在浆液性卵巢癌组织及正常卵巢组织中的表达 采用免疫组化检测STC2在浆液性卵巢癌组织与正常卵巢组织中的表达(图4)，102 例浆液性卵巢癌组织中STC2 高表达33 例(32.35%)，低表达69 例(67.65%)，26 例正常卵巢组织中STC2 高表达仅1 例(3.85%)，其余25例(96.15%)均为不表达或者表达量很低，且两组间比较差异有统计学意义(P=0.002 3)，提示STC2可能是浆液性卵巢癌的诊断标志物。

图4 STC2在浆液性卵巢癌及正常卵巢组织中的表达(SP)Figure 4 Expression of STC2 in serous ovarian cancer and normal ovarian tissue(SP)

2.5 STC2表达水平与浆液性卵巢癌患者生存预后的关系 对收取的102例浆液性卵巢癌患者进行随访(8 例患者失访)，中位随访时间为18.94 个月，使用Kaplan-Meier 生存分析显示：与STC2 低表达的患者比较，STC2 高表达的患者生存时间更长，预后更好(图5A)，两者差异具有统计学意义(P＜0.001)。基于公共数据库中探针203438_at 以及203439_s_at 的预后数据，使用Kaplan-Meier Plotter 在线数据库(https://kmplot.com/analysis/)，对STC2 在卵巢癌中浆液癌这一病理亚型中的预后进行分析，结果显示，在浆液性卵巢癌中STC2高表达组的生存时间更长，预后更好，差异有统计学意义(P=0.022、0.006 4)，见图5B、5C。

图5 STC2在浆液性卵巢癌中的预后意义Figure 5 Prognostic significance of STC2 in serous ovarian cancer

3 讨论

STC 是一种最早在硬骨鱼鳃中发现的糖蛋白激素，其作用在于通过影响钙离子内流来降低细胞内钙的浓度，从而调节钙磷稳态[6-8]。后来，在人类及其

他哺乳动物中证实STC 由STC1 和STC2[9-10]组成，并广泛分布于多种组织中。人类STC1 位于染色体8p11.2-p21，STC2 位于染色体5q33 或5q35[11-12]。其中STC2 在脊椎动物中高度保守，根据The Human Protein Atlas 数据库显示，STC2 广泛表达于肾、卵巢、骨骼、神经元和肌肉等多种组织，并在维持矿物质稳态和促进肿瘤生长的过程中发挥重要作用，目前已在多种癌症中发现STC2 存在差异表达，且这种差异表达对患者的预后具有预测价值[3，13-16]。

本研究基于公共数据库对STC2 在多种癌种中的差异表达、预后及免疫浸润进行分析发现，STC2在24个癌种中均为高表达状态，且其高表达状态与20个癌种的患者更差的预后相关，进一步分析提示，STC2的表达水平与21个癌种的免疫浸润状态相关，以上数据提示，STC2 在肿瘤的发生发展中可能起着重要的作用。本文重点对STC2在卵巢癌样本中表达水平进行了验证，结果提示STC2 在卵巢癌的表达明显高于正常组，这与前文泛癌分析结果基本一致，从而互相印证。进一步的预后分析显示，在卵巢癌中STC2 高表达的患者生存时间更长，预后更好，提示STC2对患者的预后有预测价值。

文献报道，STC2 与卵巢癌上皮间质转化相关，其可增加乏氧卵巢癌细胞的迁移和侵袭，与患者的生存时间呈负相关关系[14]。此外，STC2 可下调E-cadherin的表达，上调N-cadherin、Vimentin 以及基质金属蛋白MMPs-2 和9 的表达，并且通过调控缺氧诱导因子HIF-1促进卵巢癌细胞的增殖[15]。Law等[17]报道STC2在卵巢癌细胞系SKOV3、OVCAR3 及CaOV3 低表达。本文基于公共数据库的分析，STC2 在多个癌种中存在差异表达，并且与多个癌种的患者预后及免疫浸润存在明显的相关性。无论是公共数据库的浆液性卵巢癌队列或者本地浆液性卵巢癌队列的数据分析显示，STC2蛋白在正常卵巢组织中表达很低，甚至不表达，但在高级别浆液性卵巢癌组织中高表达，表达越高预示着患者的生存时间更长，这与上述文献中报道的似有不符，然而文献报告中研究对象多为上皮性卵巢癌，而本文中的预后主要针对上皮性卵巢癌中浆液性这一病理亚型进行的分析，上述的不一致意味着STC2在不同病理类型卵巢癌的发生及发展中的作用机制可能不同。临床上，不同病理类型的卵巢癌在发病机制、生物学行为及预后亦存在较大差异，基于本文的这些发现，为临床上后续进一步研究STC2 在不同病理类型卵巢癌生物学中的作用以及引起这种差异可能的机制奠定基础，体现精准医学的理念，为STC2作为浆液性卵巢癌潜在的生物标志物和治疗靶点提供理论依据。