miRNA-23a-3p和TLR4在急性脑出血患者血清中的表达及临床意义

贺琦，王燕

西安宝石花长庆医院神经内科，陕西 西安 710201

急性脑出血(acute cerebral hemorrhage，ACH)是一种颅内出血性疾病，其发病率高，预后差[1-2]。因此，寻找与ACH 发病及预后转归相关的指标，对及时干预，改善ACH 患者预后有积极意义。有研究认为，ACH发病与炎症反应、微小RNA(microRNA，miRNA)表达失调、信号传导异常等相关[3-4]。研究发现，微小RNA-23a-3p(microRNA-23a-3p，miR-23a-3p)在ACH患者中呈高表达，与血肿体积、ACH 患者预后相关，可能参与并影响ACH 患者预后[5]。此外，研究发现脑出血患者Toll 样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)水平较高，是影响脑出血预后的危险因素，且具有评估ACH 患者预后的潜在价值[6]。但miR-23a-3p、TLR4在ACH患者中的相关性，及两者联合预测ACH患者预后的价值尚未明确。基于此，本文通过测定miR-23a-3p、TLR4 在ACH 患者血清中的水平，旨在分析miR-23a-3p与TLR4的相关性以及miR-23a-3p、TLR4联合检测对ACH患者预后的预测价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020 年1 月至2022 年3 月西安宝石花长庆医院诊治的ACH 患者110 例作为ACH 组。纳入标准：(1)符合《中国脑出血诊治指南(2019)》[7]中有关ACH 的诊断标准；(2)首次发病，入院就诊＜4 h；(3)检查资料齐全。排除标准：(1)凝血功能障碍者；(2)伴有感染、糖尿病、传染病者；(3)近1 个月服用抗血小板药物者；(4)合并肝肾功能不全、自身免疫系统疾病者；(5)因蛛网膜下腔出血、外伤等引发的继发性脑出血者；(6)脑血管畸形导致的颅内出血者。ACH 组患者中男性56 例，女性54 例；年龄61～73 岁，平均(69.98±7.24)岁。另纳入同期健康体检者110例作为对照组，其中男性61 例，女性49 例；年龄61～73 岁，平均(68.73±7.11)岁。两组受检者的性别和年龄比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有受试者及其亲属对本研究知情同意。

1.2 检测方法

1.2.1 样本收集 收集ACH患者入院治疗前，及健康者体检当日3～5 mL空腹外周血，自然凝集，分离出血清(4 000 r/min离心10 min)，分装，存于-70℃冰箱。

1.2.2 血清miR-23a-3p 表达水平测定 采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription- polymerase chain reaction，qRT-PCR)法测定血清miR-23a-3p 表达水平。首先，按miRNeasy Serum/Plasma Kit (217184，北京索莱宝科技有限公司)说明书提取血清样本总RNA，且在提取RNA 时加内参cel-miR-39。其次，利用miScript Reverse Transcription Kit(218061，杭州开泰生物技术有限公司)获得cDNA。最终，应用miScript SYBR Green PCR Kit(218075，北京欣华绿源科技有限公司)配制反应体系，qRT-PCR 仪(StepOne TM，美国ABI 公司)将cDNA 扩增、检测。qRT-PCR 扩增参数：96.5℃8 min；94℃30 s，64.5℃40 s，70℃20 s，40 个循环。miR-23a-3p 上游引物序列为5'-ACACTCCAGCTGGGATCA-3'，下游引物序列为5'-CTCAACTGGTGT CGT-3'，cel-miR-39 上游引物序列为5'-CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3'，下游引物序列为5'-CCAGTGCGTGTCGTGGAGTC-3'。血清miR-23a-3p相对表达量以2-△△CT法计算。

1.2.3 血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、TLR4、核因子κB(NF-κB)水平测定 采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定血清TNF-α、TLR4 和NF-κB 水平。采用人TNF-αELISA试剂盒(70-EK182HS-96，杭州联科生物技术股份有限公司)、人TLR4 ELISA 试剂盒(CSB-E12954h-1，上海恒斐生物科技有限公司)、人NF-κB ELISA 试剂盒(XFH11333，上海信帆生物科技有限公司)配制TNF-α、TLR4、NF-κB的标准样品溶液，解冻血清，酶标仪(美国Awareness公司，Chromate 4300)测定TNF-α、TLR4、NF-κB标准品溶液及血清样本在450 nm处的吸光度，绘制TNF-α、TLR4、NF-κB 的标准回归曲线，结合TNF-α、TLR4、NF-κB 的标准回归方程，计算血清TNF-α、TLR4、NF-κB水平。

1.3 治疗与随访 ACH 患者均依据《中国脑出血诊治指南(2019)》[7]给予ACH患者降颅内压、吸氧、脑保护剂等对症治疗。对110例ACH患者随访6个月，对患者进行改良Rankin量表(modified Rankin scale，mRS)评估，并依据mRS评分将其分为预后良好组(58例，mRS评分＜3分)、预后不良组(52例，mRS评分≥3分)。此外，收集整理两组ACH 患者美国国立卫生研究院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS)、年龄、高脂血症、性别、高血压、血小板分布宽度、身体质量指数(body mass index，BMI)、糖尿病等资料。

1.4 统计学方法 应用SPSS25.0 软件进行数据统计学分析。计量资料均符合正态分布，以均数±标准差()表示，组间比较采用t检验；计数资料比较采用χ2检验，理论频数＜5 时，采用Fisher 精确概率法分析；ACH患者血清miR-23a-3p、TLR4水平与TNF-α、NF-κB 的相关性采用Pearson 法分析；采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)评估血清mmiR-23a-3p、TLR4预测ACH患者预后的价值。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受检者的血清miR-23a-3p、TLR4、TNF-α、NF-κB 水平比较 与对照组相比，ACH 组患者血清miR-23a-3p、TLR4、TNF-α、NF-κB 水平均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 两组受检者的血清miR-23a-3p、TLR4、TNF-α、NF-κB 水平比较()Table 1 Comparison of serum levels of miR-23a-3p,TLR4,TNF-α and NF-κB between the two groups()

表1 两组受检者的血清miR-23a-3p、TLR4、TNF-α、NF-κB 水平比较()Table 1 Comparison of serum levels of miR-23a-3p,TLR4,TNF-α and NF-κB between the two groups()

组别对照组ACH组t值P值例数110 110 miR-23a-3p 1.01±0.30 2.29±0.67 18.287 0.001 TLR4(μg/L)17.46±5.82 32.94±10.98 13.065 0.001 TNF-α(pg/mL)20.31±8.47 51.28±21.37 14.130 0.001 NF-κB(ng/mL)8.50±3.04 17.34±6.19 13.444 0.001

2.2 ACH 患者血清miR-23a-3p、TLR4 水平与TNF-α、NF-κB的关系 经Pearson法分析结果显示，ACH患者血清miR-23a-3p、TLR4水平与TNF-α、NF-κB 均呈正相关(r=0.377、0.538、0.403、0.572，P＜0.05)，见表2；ACH 患者血清miR-23a-3p 表达水平与TLR4呈正相关(r=0.581，P＜0.05)，见图1。

图1 ACH患者血清miR-23a-3p表达水平与TLR4的相关性Figure 1 Correlation between serum miR-23a-3p expression level and TLR4 in patients with ACH

表2 ACH 患者血清miR-23a-3p、TLR4 水平与TNF-α、NF-κB 的相关性Table 2 Correlation of serum miR-23a-3p and TLR4 levels with TNF-α and NF-κB in ACH patients

2.3 不同预后ACH 患者的一般资料及血清miR-23a-3p、TLR4、TNF-α、NF-κB 水平比较 与预后良好组相比，预后不良组ACH患者NIHSS评分、脑出血体积、血清miR-23a-3p、TLR4、TNF-α、NF-κB水平均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，年龄、高脂血症、男/女比、高血压、血小板分布宽度、BMI、糖尿病比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表3 不同预后ACH患者的一般资料及血清miR-23a-3p、TLR4、TNF-α、NF-κB水平比较[，例(%)]Table 3 Comparison of general data and serum levels of miR-23a-3p,TLR4,TNF-α and NF-κB in ACH patients with different prognosis[,n(%)]

表3 不同预后ACH患者的一般资料及血清miR-23a-3p、TLR4、TNF-α、NF-κB水平比较[，例(%)]Table 3 Comparison of general data and serum levels of miR-23a-3p,TLR4,TNF-α and NF-κB in ACH patients with different prognosis[,n(%)]

临床指标年龄(岁)NIHSS评分(分)高脂血症(是/否)男/女脑出血体积(mL)高血压(是/否)血小板分布宽度(%)BM(kg/m2)糖尿病(是/否)TNF-α(pg/mL)NF-κB(ng/mL)miR-23a-3p TLR4(μg/L)预后良好组(n=58)69.87±7.11 10.48±3.50 12(20.69)/46(79.31)31(53.45)/27(46.55)22.25±7.42 34(58.62)/24(41.38)16.10±4.03 22.08±2.27 14(24.14)/44(75.86)38.07±15.86 12.42±4.44 1.71±0.50 24.52±8.17预后不良组(n=52)70.14±7.32 18.26±6.09 14(26.92)/38(73.08)25(48.08)/27(51.92)33.82±11.27 32(61.54)/20(38.46)16.03±4.00 22.27±2.31 15(28.85)/37(71.15)66.01±27.51 22.83±8.16 2.94±0.85 42.33±14.11 t/χ2值0.196 8.319 0.590 0.317 6.421 0.097 0.091 0.435 0.313 6.608 8.426 9.363 8.203 P值0.845 0.001 0.442 0.574 0.001 0.755 0.927 0.665 0.576 0.001 0.001 0.001 0.001

2.4 血清miR-23a-3p、TLR4 水平对ACH 患者预后的评估价值 经ROC 分析结果显示，血清miR-23a-3p 预测ACH 患者预后的曲线下面积(area under curve，AUC)为0.857 (95%CI：0.781～0.933)，截断值为2.37，约登指数为0.648，其敏感度、特异性分别为76.9%、87.9%；TLR4 预测ACH 患者预后的AUC 为0.868 (95%CI：0.800～0.937)，截断值为34.52 μg/L，约登指数为0.621，其敏感度、特异性分别为78.8%、86.2%；miR-23a-3p、TLR4联合预测ACH患者预后的AUC为0.941(95%CI：0.893～0.990)，约登指数为0.801，其敏感度、特异性分别为90.4%、89.7%，见图2。

图2 血清miR-23a-3p、TLR4预测ACH患者预后的ROC曲线Figure 2 ROC curve of serum miR-23a-3p and TLR4 in predicting prognosis of patients with ACH

3 讨论

ACH 是因非外伤性脑血管破裂引发的一种脑内出血病变，起病急，经治疗后，部分患者可能伴有神经功能缺损，发生不同程度残疾，甚至死亡[8-9]。因此，寻找与ACH 病理变化相关，且可有效预测ACH 患者预后的方法十分重要。

miRNA是一类不编码蛋白的RNA小分子，其可调控信号转导、参与炎症反应、介导自噬，并可调节细胞凋亡，与蛛网膜下腔出血、ACH等关系密切[10-11]。研究发现，miR-23a-3p 在心肌梗死中表达失调，可能是评估心肌梗死患者预后的标志物[12]；另外，miR-23a-3p在脑出血患者中过表达，经针灸治疗后，miR-23a-3p 表达水平降低，miR-23a-3p 可能通过影响炎症反应、神经元细胞凋亡过程进而在脑出血中发挥调节作用[13]。本研究中ACH 患者血清miR-23a-3p 表达水平较高，提示miR-23a-3p 可能与ACH 的病变过程相关，推测miR-23a-3p 可能通过调节信号转导、影响炎症反应，调控细胞凋亡进而参与ACH 病理发展，但其机制仍需深入探讨。本研究又分析血清miR-23a-3p 表达水平与ACH 患者预后的关系，结果发现，预后不良的ACH患者血清miR-23a-3p高表达。为进一步探究血清miR-23a-3p的临床意义，进行了ROC曲线分析，结果显示，血清miR-23a-3p 预测ACH 患者预后的AUC为0.857，且当血清miR-23a-3p 相对表达量＞2.37 时，ACH 患者发生不良预后概率较高，提示miR-23a-3p不仅与ACH 患者预后有关，还可能作为ACH 患者预后预测的辅助指标。

TLR4 是Toll 样受体家族的一员，是一种膜蛋白，其主要分布于神经小胶质细胞，可诱导炎症反应，与脑出血的神经损伤密切相关[14-15]。研究发现，TLR4在脑出血中呈高水平，经麦角甾苷治疗后，TLR4水平下降，TLR4 可能通过促进炎症反应进而影响脑出血病理过程[16]；另外，周喜燕等[17]也研究发现脑出血大鼠脑组织中TLR4表达水平升高，TLR4可能促进脑组织损伤，增加血脑屏障通透性，其与神经功能显著相关。本研究中ACH患者血清TLR4水平高于健康者，与既往研究[16-17]类似，提示TLR4可能参与ACH发病进程，推测TLR4可能通过影响炎症反应，进而影响ACH发生发展，其具体机制有待深入探讨。进一步研究发现，预后不良的ACH 患者血清TLR4 高于预后良好者，提示TLR4 可能与ACH 患者预后相关，推测高水平TLR4 通过促进炎症反应进而影响ACH患者预后。随后的ROC曲线分析显示，血清TLR4预测ACH患者预后的AUC 为0.868，当血清TLR4 水平＞34.52 μg/L 时，ACH患者发生不良预后风险较大，提示TLR4对ACH患者预后有一定预测价值，测定血清TLR4 水平有助于临床预测ACH患者的预后情况。

近年来，关于miRNA 与下游靶基因的3'-非翻译区结合，抑制翻译或降解mRNA，进而调控疾病进展方面的研究越来越多。miR-23a-3p 靶向TLR4 调控疾病进程的研究目前已有报道，如Gao 等[18]研究发现，miR-23a-3p 可以通过调节TLR4 表达，进而影响脓毒症的炎症反应过程，Chen 等[19]发现结核患者中miR-23a-3p的下调通过靶向IRF1/SP1的TLR4/TNF-α/TGF-β1/IL-10信号传导抑制单核细胞的功能和吞噬作用，目前关于miR-23a-3p/TLR4在ACH中的作用报道较少，故本研究分析了ACH 患者血清miR-23a-3p表达水平与TLR4的关系，结果显示，血清miR-23a-3p表达水平与TLR4呈正相关，提示miR-23a-3p可能与TLR4 相互作用进而影响ACH 发生发展，但其机制需结合基础实验加以证实。进一步研究显示，血清miR-23a-3p、TLR4 联合预测ACH 患者预后的AUC 为0.941，敏感度为90.4%，特异性为89.7%，提示miR-23a-3p、TLR4 联合可提高对ACH 患者预后的预测价值，为临床判定ACH患者预后提供新思路。

综上所述，ACH患者血清miR-23a-3p、TLR4水平较高，miR-23a-3p与TLR4呈正相关，且miR-23a-3p、TLR4 均与ACH 患者预后相关，两者联合检测可提高预测ACH 患者预后的价值，为临床预测ACH 患者预后提供新思路。但后期仍需深入探讨miR-23a-3p、TLR4 在ACH 中的机制，为诊治ACH、评估ACH 患者预后增加说服力。