植物乳杆菌的生理特性及影响其增殖的因素

马翠柳，王金铭，袁伟涛，赵德辉，刘晗璐

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112；2.河北科技师范学院，河北 秦皇岛 066000；3.赤峰学院，内蒙古 赤峰 024000）

乳酸菌为当今益生菌生产应用中最广泛的菌种，乳酸杆菌属包含50 多个不同的物种，在乳酸菌中占据主要地位。植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为其中一种乳酸杆菌，在生活生产中较易获取，主要途径有土壤、植物、乳制品、果汁、肉类和肠道等。不同来源的植物乳杆菌都可因其益生特性在生产中得到广泛应用。植物乳杆菌耐受胃肠液的消化环境，可定植于肠道内，菌体存活率可接近100%。植物乳杆菌的抑菌能力在一定程度上可抵御肠道内致病菌的侵袭，间接提高机体免疫力；抑制食品中腐败菌的生长，更有利于食品贮存。自身营养缺陷特性导致植物乳杆菌在生长过程中必须依靠生存环境提供的碳氮源，且菌体生长速度受发酵条件的影响较大。因此本文将主要综述植物乳杆菌的生理特性以及影响其生长的因素，旨在为植物乳杆菌的研究和生产提供参考。

1 植物乳杆菌生理特性

植物乳杆菌是一类革兰氏阳性厌氧或兼性厌氧、兼性异型发酵乳酸菌[1]，可在15 ℃条件下生长，在45 ℃以上不生长，最适生长温度30~37 ℃。在pH 4.5~9.5生长，最适pH 为6.5 左右[2,3]。植物乳杆菌广泛存在于自然界中，因其益生特性和安全性，常用于食品发酵、动物饲料、工业乳酸菌发酵和医疗保健等产业中[4]。不同来源的植物乳杆菌代谢过程中会产生不同的代谢物，主要为有机酸、小肽、细菌素、过氧化氢和蛋白酶等活性物质，可发挥抑菌作用，还可用于调节肠道菌群平衡、调节机体免疫功能及降低血清胆固醇含量等作用[5,6]。在研究植物乳杆菌的营养物质代谢过程中发现，植物乳杆菌属化能异养菌，生理系统缺少对多种化合物的合成能力，如糖类、氨基酸、生长因子和矿物质等，这类物质须从外界获取[7]。

2 影响植物乳杆菌生长的因素

2.1 发酵底物的影响

2.1.1 氮源 氮源对植物乳杆菌的生长具有重要作用，菌体生长和代谢均需要氮源，主要用于菌体细胞壁（蛋白质、氨基酸）和代谢产物的合成[8]。植物乳杆菌对无机氮的分解利用率较低，因此，只能依赖一些富含氨基酸、肽类等小分子提供氮源。植物乳杆菌YM-4-3 可在不同氮源中培养，当柠檬酸铵作为单一氮源添加时，菌体代谢速度最快，且苯乳酸产量达到最大值[9]。酵母浸粉因在中性和酸性环境中热稳定较好，富含多种氨基酸，常被作为氮源用于培养基中[10]。刘利利等[11]研究发现，不同添加量的酵母浸粉也会对植物乳酸菌菌体生长产生影响，浓度为25 g/L 和35 g/L 时，菌体活菌数相当。但由于植物乳杆菌生理结构原因，酶体系较为简单，无法合成多种氨基酸，仅添加酵母浸粉无法满足氮源需求[12]。为进一步优化氮源，促进植物乳杆菌生长，李景良等[13]在最佳单一氮源添加物的基础上，探讨了混合氮源的促生长效果，经多次试验验证得出最佳组合是酵母提取物10 g/L、蛋白胨10 g/L、柠檬酸三铵2 g/L。随着研究的不断深入，未来对乳酸菌适宜氮源的寻找和开发也一直是生产和科研的发展目标。

2.1.2 碳源 碳元素是构成细胞物质的基础，也是培养基组成的主要成分，主要提供微生物生长繁殖所需能源、菌体合成所需的碳骨架及提供菌体合成目的代谢产物的原料；植物乳酸杆菌缺乏可分解大分子碳水化合物的酶系，所以常利用一些单糖来维持生长[9]。单糖无需分解，因此减少了菌体的能量消耗，进一步促进了植物乳杆菌的生长和繁殖；对一株具有强抑菌能力的植物乳杆菌进行培养基优化，葡萄糖可作为植物乳杆菌最佳碳源，其菌体的生物量远高于淀粉组和乳糖组，添加量为3% 时菌体密度达到最大[14]。在培养植物乳杆菌ATCC14917 过程用等量的低聚果糖代替葡萄糖，植物乳杆菌在低聚糖中的生长速率低于在葡萄糖中的生长速率。这可能是因为葡萄糖是一种单糖，最适合乳酸菌的生长[15]。大豆低聚糖由单糖基分子构成，同样可以作为碳源添加在培养基；在植物乳杆菌ZPL001 培养过程中，添加比例为3%时，其体外促生长作用显著优于葡萄糖[16]。但也有研究表明，植物乳杆菌的碳源为蔗糖时可促进菌体的生长，且喷雾干燥后的活菌数明显提高，可达4.2 109CFU/mL，表明植物乳杆菌也可以利用蔗糖作为碳源，此外蔗糖还可对抗干燥时所引起的高温，保护菌体活性不受破坏，减少菌株在干燥保存过程中菌体量的损失[17]。对植物乳杆菌MDL1118[3]进行实验室小规模扩大生产时，采用5%的蔗糖作为培养基的主要碳源，减轻了pH 对菌体生长的抑制作用，使7 h 静止培养的活菌数达到3.18 109CFU/mL[18]。

2.1.3 碳氮总量 碳氮都是限制性底物，碳氮源总量多少和碳氮比例会影响着微生物细胞生长及发酵产物的合成[1]。碳氮比维持在一定范围时，菌株生长情况较好；氮源过多会使微生物生长过快，容易导致细胞老化和自溶；碳源过多时会使培养环境偏酸性化，不利于微生物生长[19]。植物乳杆菌在原始培养基的基础上维持4:6 的碳氮比不变，增加碳氮总量，菌体密度随着总量的添加而增大，在7.5 倍时达到最大值[20]。

2.2 发酵条件的影响

2.2.1 培养温度 温度是保证各种酶活性的重要条件，一系列的酶促反应是微生物生命活动的基础，适宜的温度提供生长繁殖环境，促进微生物代谢产物的合成[17]。温度过低，酶的活性受到抑制，酶促反应缓慢，导致菌体生长和代谢缓慢；温度过高，会导致菌体蛋白变性，影响RNA和核糖体等大分子物质的正常代谢[21]。对于不同的植物乳杆菌菌株，培养温度有一些差异。有研究表明，35 ℃是植物乳杆菌ZJ316 菌体生长的最佳温度[22]。对植物乳杆菌LP-S2 培养时，在33~37 ℃时，菌液OD 值均保持在较高的浓度，但当培养温度达到40 ℃和42 ℃时，菌液浓度显著下降[23]。所以通常情况下植物乳杆菌的发酵温度选择为33~37 ℃。但在应用植物乳杆菌进行发酵生产时，根据发酵底物不同，选择的发酵温度不同，如在发酵椰奶时，发酵温度为39℃[24]。利用植物乳杆菌R23 发酵苹果酸时的最佳发酵温度为30 ℃，其产量是优化前的2.3 倍[25]。目前对于高生产效率植物乳杆菌的低温筛选和驯化也是科研和生产人员共同在研究探讨的问题。

2.2.2 pH 植物乳杆菌的生长很大程度上取决于于酸性环境，当pH 大于7. 5 或小于4. 5 时，细菌生长缓慢或停止。生长过程中植物乳杆菌利用碳水化合物（主要指葡萄糖）产生大量乳酸[26]，菌体的生长代谢和乳酸的产生都会随终产物——乳酸的积累而受到抑制[27]。由于各乳酸菌所适应的pH值环境有所差别，菌株对培养环境中氢离子浓度的适应能力也有一定的范围。接种植物乳杆菌B23 时，pH 为7.0 时，活菌数最高，这个值也是MRS 培养基的自然pH[28]。将植物乳杆菌培养基置于不同pH，37℃下恒温培养18h 后发现pH 为7.0~7.5 时活菌数最高[29]。适当的酸性环境压力可以改变微生物的生物合成和新陈代谢[30]，在培养植物乳杆菌299 时，为减少盐的产生，将pH 定为5.5。发酵BLPS-9 的最佳pH 为6，这两种菌体培养pH 均低于MRS自然pH，但可以明显提高菌体冻干存活率[31]。因此，对于不同菌株的pH 仍需通过实验或生产实践进行进一步验证。

2.2.3 发酵时间 菌种发酵需要一定的时间，时间过短时活菌数不高；时间过长时，发酵培养基中的水分流失增加，导致含水量下降，不利于菌体生长。Plackett-Burman 试验结果中时间对植物乳杆菌LPL-1 菌株的发酵有显著影响，发酵时间为32 h 时，最有利于菌体产细菌素[32]。通常情况下，细菌素生产与细菌生长同步，细菌素只在菌体生长时合成。植物乳杆菌B002 培养4 h后进入对数生长期，菌体快速生长繁殖，随后进入稳定期，培养到20 h 时菌体密度达到最大值[33]。发酵时间可在优化后的培养基中发生改变，植物乳杆菌200655 在培养24 h 与优化前的时间缩短了2 h，因此对于不同菌株的具体培养时间，需要根据菌株特点进行进一步确定。

2.2.4 接种量 接种量的大小是决定菌种在发酵过程中的生长繁殖速度的关键，相对较大的接种量会促进菌体发酵，减少杂菌污染；但是接种量过大时菌体生长过快，导致衰老细胞增加，发酵后劲不足；过低的接种量会延长迟缓期，增加发酵周期，也更易污染杂菌[23]。不同的接种量会影响菌株的生长代谢，找到适合的接种比例与生产过程中活菌数的多少呈直接关联性[28]。关秀艳等[34]对植物乳杆菌LP1103 的接种量进行处理分析时发现，不同的接种量对活菌数的影响呈曲线分布，菌体活菌数在接种量为5% 时达到最高。但对变异菌株植物乳杆菌P1881 进行优化，发现其接种量为4%时，菌株生长性能最佳，且代谢产物苯乳酸的产量显著性增加[35]。

2.2.5 接种的菌龄 每种菌株生长速度不同，因此最适菌龄也不同。菌株过嫩，会导致生物量太少，微生物生长缓慢；培养时间过长，菌种老化，培养基失水严重，菌种干缩，活力下降，也会影响菌种的生长[17]。试验发现菌龄为6 h时，菌株经干燥后的发酵活菌数值较低，但菌龄为8 h 时，干燥后活菌数较6 h 增加0.65 倍。植物乳杆菌在辣椒汁发酵培养基中菌龄为21 h，发酵周期为27 h，活菌数可以达到4.9 1010CFU/mL[36]。

2.2.6 液态发酵装液量 装液量不同对菌株的生长也有较大影响。植物乳杆菌LP-S2 菌体浓度在不同装液量下差别较大：于35 mL 容器中进行发酵，装液量为10 mL时菌体浓度达到最大值；随着装液量的增加，菌体浓度逐渐降低[37]。主要因为装液量对培养基的溶氧有影响，装液量增加，培养基内溶氧量升高，促使酶活性提高，从而导致营养物质过多消耗，影响菌体正常生长[38]。

2.2.7 固态发酵装料量 固态发酵时，固态培养基的质量会影响菌株生长环境中的空气含量、水分含量，进而影响菌体对营养的利用与吸收；为避免固体发酵培养基搅拌不均匀，对装料量进行了试验比对，实验结果表明，400 mL 的罐头瓶中添加40 g 固体发酵培养基有利于乳酸菌的生长，高度约为4 cm[23]。但在生产实践中，具体的发酵装料量需根据生产容器体积、装料量和接种体积等具体确定。

2.2.8 生长因子 通过固态发酵纯培养植物乳杆菌的研究相对较少，原因在于植物乳杆菌的稳定性较差，干燥后菌体失活率较高，研究难度大；需要在培养基中加入一定量的生长因子后，通过固态发酵获得较高的生物量[23]。微生物生长所需的生长因子包括维生素、氨基酸、嘧啶和嘌呤；植物乳杆菌YSQ 添加300mL/L 的番茄汁，其细胞生长速度和菌落总数增加，可能是番茄汁中含有维生素和有机酸，促进乳酸菌的生长[39]。熊涛等[40]在研究中发现添加质量分数同为0.5%的番茄汁、玉米浆和维生素C 3 种生长因子，番茄汁促进菌体生长的效果最佳。邴狄祥等[41]发现采用1.0% 的番茄粉和0.5% 的菊粉作为复合促生长因子，其菌体数高达137 108CFU/g，大约是单独添加这两种因子的2 倍。有研究证明菊粉中的水溶性纤维可促进短链脂肪酸的产生，更有利于菌体的生长[42]。

2.2.9 中和剂 植物乳杆菌在生长过程中会产生大量乳酸及其他一些酸性物质，虽然适宜的酸性条件会促进菌体生长，但随着菌体的生长繁殖，会导致酸性物质积累过多，从而会阻碍乳酸菌生长，导致培养基中活菌数降低[9]。植物乳杆菌在高密度培养过程中会产生大量的有机酸，为缓解环境中的酸抑制作用，延长菌体的生长期，通常会在菌体对数生长末期补料时向培养基中添加一定量的中和剂，将pH 调至7. 0 左右[11]。但在酸奶发酵过程中，选取2%磷酸氢二钠+磷酸二氢钠作为最佳缓冲剂体系，并在培养13 h 开始每隔2 h 添加一次的情况下，最有利于菌体生长[43]。发酵植物乳杆菌ZJ316 时同样选用了磷酸氢二钠+磷酸二氢钠作为缓冲盐，但发酵后的菌体浓度明显不如添加量为0.12 mol/L磷酸氢二钠+柠檬酸缓冲剂组合[44]。分析其可能原因是ZJ316 常用于生产细菌素，其过程中产生大量酸性代谢物，增强了菌体酸性环境[45]，而柠檬酸的氧化能力较强，在氧化过程中会有碱性物质产生，使菌液pH 上调速度更快，从而促进菌体的生长[46]。

2.2.10 水苏糖 水苏糖是自然界存在的一种益生元，属-低聚半乳糖，通过产生乳酸、乙酸和短链脂肪酸等酸性物质，降低肠道pH，来达到抑制肠道病原菌生长繁殖的效果，同时诱导合成促细胞分裂素，促进益生菌的增殖。有研究表明，乳糖作为碳源发酵4 h添加0.6%水苏糖，植物乳杆菌RB1 增殖效果最佳；优化发酵条件前，RB1 活菌数为2.19 109CFU/mL；优化后，发酵液中RB1 活菌数为1.86 1010CFU/mL，接近优化前活菌数的10 倍[47]。

2.2.11 超声波 发酵前期乳酸菌数量快速增加，发酵中后期乳酸菌数量趋势变得缓慢甚至下降；合适的低强度超声处理可加速微生物细胞生长，促进次级代谢产物的生成，发酵液pH 快速下降[48]。经过25 w/L 和30 w/L 超声处理的发酵液在36 h 中植物乳杆菌的数量达到1.7 108CFU/mL 和1.9 108CFU/mL，明显高于对照组（4.0 107CFU/mL）[49]。

3 展望

不同发酵底物和条件下所获得的菌体量及代谢产物大不相同，不断优化发酵条件是提高菌株在发酵、饲料等行业中应用的关键。但由于不同来源的植物乳杆菌其生长特性或代谢产物有所差别，其影响因素在发酵过程中对量的需求有所变化，在生产过程中要注意根据菌体的生长需求将发酵条件调整到最佳适宜量，将菌体的扩大再生产达到最大化，并减少因控制量不明确而导致的资源浪费。为此，我们常在筛选影响菌体生长因素过程采用单因素试验，将培养基成分确定后结合Plackett-Burman 试验设计、中心优化组合、响应面法及CCD试验设计综合考虑各因素及其交互作用，进一步确定培养基各成分的最佳添加水平。目前来看，大多优化方案结合以上几种试验设计来达到促进菌体增殖的效果，使得植物乳杆菌在畜牧、食品加工、医疗等行业的应用更加广泛。