梅花鹿魏氏梭菌病的诊断与防治

王晓旭，鲍坤，徐超，王凯英，杨镒峰，刘志杰

（中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112）

魏氏梭菌病（Clostridial gastroenteritis, Clostridial toxicosis）又称魏氏梭菌中毒症（Clostridial toxicosis）或产气荚膜梭菌性肠炎（Clostridial gastroenteritis），是由梭菌属产气荚膜梭菌类细菌引起的多种动物共患的一种剧烈腹泻为特征的急性、致死性肠毒血症疾病，该病常突然发病死亡，没有任何症状，以小肠部分坏死、消化道出血和全身实质器官病变为特征[1,2]。近年来，该病的发病率逐年上升，给养鹿业造成巨大的经济损失[3-5]。正常情况下进入健康梅花鹿消化道的魏氏梭菌很少，产生少量毒素，随粪便排出体外而不表现致病[6,7]。当梅花鹿采食了被该菌芽孢污染的饲草和饮水时可引发该病。梅花鹿采食大量高蛋白饲料、冰冻的青储饲料、饲料组成突然改变或被大量芽孢污染的青草，瘤胃微生态动态平衡被打乱，饲料在瘤胃内过度发酵，大量未消化好的饲料进入肠道，致使魏氏梭菌过度繁殖，产生大量毒素，机体不能及时排除，吸收入血，引起中毒。2015 年3 月至2020 年7 月，吉林省、黑龙江省、辽宁省和内蒙古等梅花鹿养殖场大批梅花鹿发生腹泻并死亡，经过临床症状、病理变化和病原学等方面诊断，确定是魏氏梭菌引起的腹泻和死亡，筛选分离菌株的敏感药物，经过治疗后腹泻得到了治愈，现报告如下。

1 材料

1.1 样品采集

无菌采取死亡梅花鹿肠道内容物，带回实验室，置4 ℃冰箱中保存，备用。

1.2 主要试剂

Ex Taq DNA 聚合酶、pMD18-T 载体、E.coli DH5感受态细胞购自宝生物工程（大连）有限公司；药敏纸片购于杭州天和微生物试剂有限公司；DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒购自AXYGEN 公司；胰酪胨大豆肉汤培养基购于青岛海博生物技术有限公司；PCR 引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；革兰氏染色液购于天根生化科技（北京）有限公司；厌氧产气袋、厌氧培养罐购于三菱瓦斯化学株式会社。

1.3 实验动物

BALB/c 小鼠购于苏州西山生物技术有限公司。

2 方法

2.1 流行病学调查

通过询问畜主了解梅花鹿发病经过、饲养管理、用药和免疫等情况。

2.2 临床症状和病理变化

通过临床症状和病理剖检，了解梅花鹿的临床症状和病理变化，并初步得出诊断结果。

2.3 肠内容物涂片和镜检

2.4 细菌分离鉴定与主要毒素基因扩增

无菌取肠道内容物，接菌环挑取内容物于胰蛋白胨大豆肉汤固体培养基上划线，置于37 ℃培养24~72 h，挑取可疑菌落接种于胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基。根据GenBank 已发表的细菌16S rRNA 基因和5 种主要毒素基因序列，利用Primer 5.0 设计一对通用引物和特异引物，引物序列，见表1。反应条件：95 ℃预变性5min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸50s，30 个循环；最后72 ℃延伸10 min。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

2.5 动物致病性实验

将16 株纯化的菌株接种液体培养基，37 ℃，培养48h，BalB/c小鼠腹腔注射分离菌株，每株菌株接种6 只小鼠，菌液浓度均调整为1 109cfu/mL，每只小鼠注射300L 菌液，连续观察3 d，记录小鼠死亡情况，阴性组小鼠注射300L 生理盐水，空白组无任何处理。

2.6 药敏试验

药敏试验根据美国临床标准委员会（NCCLS）推荐的方法进行。试验所选择药物包括下列抗生素：卡那霉素、新霉素、氧氟沙星、氟苯尼考、左氧氟沙星、菌必治、强力霉素、氯霉素、阿莫西林、链霉素、阿米卡星和庆大霉素。

3 结果

3.1 临床症状

发病梅花鹿的特点，发病急，死亡快，最急病程仅几个小时就死亡。很少见到明显症状，一般发病十几个小时左右死亡，个别延迟到3 d左右。病程长的病鹿可见食欲减退或废绝，精神萎靡，离群单独活动，呼吸困难，鼻镜干燥，口流涎，反刍停止；病鹿腹围增大，体温升高到41 ℃左右，病危期眼脸肿胀，可视黏膜发绀；粪便带血，运步拘紧，临死时呈现角弓反张；肛门周围常常被血液污染，含有大量黏液，呈酱红色，并有腥臭味；死前口吐白沫，运动失调，后肢麻痹，昏迷倒地，见图1。

图1 梅花鹿的临床症状Fig.1 Clinical symptoms of sika deer

图2 梅花鹿的病理变化Fig.2 Pathological changes of sika deer

图3 细菌革兰氏染色结果Fig.3 Bacterial Gram staining results

图4 分离菌株16 S rRNA 基因PCR 鉴定结果Fig.4 16S rRNA gene amplification results of the isolated strain

图5 分离菌株Alpha 毒素基因PCR 鉴定结果Fig.5 Alpha toxin gene amplification results of the isolated strain

3.2 病理变化

病鹿口角和鼻孔有少量泡沫，腹围明显肿大；个别病鹿皮下见有胶样浸润；腹腔剖检后，有多量红黄色腹水流出；肠系膜淋巴结、大网膜、胃肠浆膜明显充血和出血，呈黑红色；网胃、瓣胃等轻微出血，皱胃胃底和幽门部黏膜脱落，呈紫红色，有大面积出血斑，严重者呈坏死状态；小肠剖开有大量红紫色“酱油样”黏液流出；肾脏稍大，变软；肝脏肿大，呈暗红色，质脆；脾脏显著肿大，呈暗黑色。

3.3 肠内容物涂片镜检

死于肠毒血症的鹿，一般很少能于脏器中分离到细菌，通常采集回肠内容物或出现明显病变的空肠内容物涂片镜检，革兰氏染色后，可见阳性粗短杆菌，两端钝圆。

3.4 细菌鉴定与毒素基因扩增

以提取细菌基因组为模板，采用T1、T2 引物进行PCR 扩增，琼脂糖电泳可见约780 bp 处有一条特异的条带，与预计产物片段大小相符，且无杂带。将PCR产物进行测序，测序结果发现，分离菌株与GenBank中魏氏梭菌16S rRNA 同源性为98%，确定分离菌株为魏氏梭菌。使用魏氏梭菌的5 种主要毒素基因进行PCR 扩增，琼脂糖电泳可见约500 bp 处有一条特异的条带，序列结果与GenBank 中α毒素基因同源性为98%，确定分离菌为A 型魏氏梭菌。

3.5 细菌毒理试验

攻毒小鼠在48 h内死亡。死亡小鼠剖检可见肠黏膜有大量出血点，心内膜有出血点，脾脏和肝脏均肿大、出血。将小鼠内脏无菌涂板进行细菌分离鉴定，鉴定结果为分离菌株和攻毒菌株相同，确定攻毒菌株为魏氏梭菌。

3.6 药敏试验

分离菌株对阿莫西林、左氧氟沙星、氧氟沙星和菌必治高度敏感，对氟苯尼考、卡那霉素、链霉素、强力霉素和氯霉素中度敏感，对庆大霉素、新霉素和阿米卡星有耐药性，见表2。

表2 药敏试验抑菌圈实验Table 2 Drug sensitivity test bacteriostatic zone test

4 防治

4.1 治疗

绝大部分病鹿的病程非常短，出现症状到死亡仅仅几分钟或几十分钟。虽然对某些菌株筛选出了敏感药物，但往往来不及治疗病鹿就已经死亡。对病情较长和受威胁的鹿群可采取抑菌消炎和对症疗法。可注射大剂量磺胺类药物和青霉素，并采用解毒、强心和补液治疗。

4.2 预防

可选用魏巴氏二联苗，鹿皮肌肉注射5 mL，免疫期6 个月。当发生本病时，病鹿马上进行隔离治疗，未发病的鹿进行紧急免疫，免疫剂量加倍。对鹿舍及周边地区进行喷雾消毒，如果气温过低可使用火碱和生石灰消毒。饲具用消毒液浸泡消毒，防止该病的蔓延，减少该病带来的损失。

5 讨论

魏氏梭菌感染主要包括外源性感染和内源性感染两种途径。外源性感染主要是鹿采食了被魏氏梭菌芽胞污染的饲料和饮水，内源性感染与应激有关，如饲料或天气突然改变，加之梅花鹿摄入被魏氏梭菌芽孢污染的饮水或饲料，其肠道会发生相应病理变化，如消化障碍、代谢紊乱，魏氏梭菌就会大量繁殖，繁殖过程中产生大量有害代谢产物和外毒素。同时病鹿肠道内的魏氏梭菌会随粪便排出体外，在环境中形成芽孢，这些芽孢被其他鹿误食，会引发更多鹿感染发病[8]。研究表明，魏氏梭菌产生的 毒素对小肠黏膜有非常强的损伤作用，胰蛋白酶可以灭活魏氏梭菌产生的 毒素[9]。但是当梅花鹿突然采食大量含有胰蛋白酶抑制剂的饲料，如大豆、花生和甘薯时[10,11]，会导致鹿肠道内的蛋白酶的分泌量减少，不能灭活 毒素，使其在肠道内大量蓄积，并粘附在肠黏膜的上皮细胞上，妨碍营养物质的吸收和运输。同时由于毒素的作用，导致肠壁的通透性增加，使大量的毒素和细菌有机会进入血液循环，引起毒血症或败血症，导致动物出现全身器官衰竭，造成死亡。

在临床样品采集过程中，我们发现魏氏梭菌病有明显的季节性，每年的2~5 月和11~12 月是该病的高发季节，尤其是3~4 月份冰雪融化、青草萌芽的时候。吉林省几个养殖场都是这个时期频繁发病，我们调查发现，这几个养殖场的共同之处是梅花鹿都是半舍饲半放牧的状态，因此，推测可能是在放牧过程中梅花鹿采食了受魏氏梭菌芽孢污染的冰冻青嫩饲料，肠道正常的消化和免疫机能受到干扰和破坏，菌群失调，魏氏梭菌大量繁殖产生毒素引发的疾病[12]。其他养殖场发病可能与采食大量含有胰蛋白酶抑制剂饲料有关，经饲养员询问，这几个养殖场都饲喂了大量豆渣、酒糟和花生饼等饲料，这些饲料含有胰蛋白酶抑制剂，会导致蛋白酶分泌不足，魏氏梭菌产生的毒素不能被蛋白酶灭活，在体内大量蓄积，最终引发疾病。

发病梅花鹿主要临床症状为食欲减退或废绝，精神萎靡，离群单独活动；粪便带血，呈番茄汁样，肛门周围常常被血液污染；眼脸肿胀，可视黏膜发绀。剖检可见整个肠道出血严重，剖开小肠有大量红紫色“酱油样”黏液流出；肝脏肿大，呈暗红色，质脆；肾脏稍大，变软。分离得到的菌株，其菌落形态、革兰氏染色结果与以往报道的魏氏梭菌相符[3]。对16S rRNA 基因及毒素基因进行PCR 扩增，测序结果发现，分离菌株与GenBank 中魏氏梭菌16S rRNA 同源性为98%，将分离得到的魏氏梭菌接种小鼠，发现小鼠在较短时间内全部死亡，且从小鼠体内分离到相同病原，综合以上结果分析确定这些鹿场是魏氏梭菌引发的疾病。

本试验虽然做了药敏试验，也筛选出来敏感药物，但是魏氏梭菌引起的疾病病程短、死亡快，往往来不及使用药物治疗，因此加强饲养管理及接种疫苗，可能是春秋有效预防魏氏梭菌病发生的必要手段。