X-射线衍射在药学中的应用研究进展

郑媛媛,聂鹏

(贵州省食品药品检验所,贵州 贵阳 550004)

X射线是一种波长很短甚至人眼不能观测的电磁辐射,其显著特征是穿透力强,是人类认识物质微观结构的主要工具之一。1895年,德国物理学家伦琴首次发现了X射线,自此,X射线技术在物质结构研究方面得到了广泛的应用,成为人类研究物质微观结构、探讨内在运行规律的重要方法。1912年,劳厄证实了X射线在晶体中的衍射现象,为X射线晶体学的产生奠定了实际应用基础。1913年,布拉格父子第一次用X射线成功地测定了NaCl的晶体结构,并提出了著名的布拉格方程,标志着X-射线晶体学的诞生[1-2],自此,人类终于掌握了认识微观世界的利器。在后续的100年里,X-射线衍射技术得到了迅猛的发展和广泛的应用,可应用于半导体物理学、固体物理学、结构化学、结构生物学、药学以及医学等,尤其是在化学和材料学基础研究方面。为彰显X-射线晶体学在人类历史发展中的重要作用,联合国教科文组织将2014年设定为国际晶体学年。本文简单介绍了X-射线衍射技术的优缺点,同时总结了该技术在药学研究领域的部分应用,为该技术在药学领域的推广使用提供了支撑。

1 X-射线衍射技术的应用

1.1 X-射线衍射仪的优点和缺点

X-射线衍射法具有检测相对快速、操作较为简单以及数据处理较为方便等优点,其数据经处理后可反映纯净化合物结构或混合物具体组成,广泛应用于化学、生物学以及药学等诸多基础研究领域。在现有使用的X-射线衍射仪主要有两种,分为X-射线单晶衍射仪(SCXRD)和X-射线粉末衍射仪(PXRD)。其中,单晶衍射仪主要用于纯净化合物的晶体结构表征,该类型仪器能直接显示晶体中的衍射数据,进而通过精修得到晶体中各个原子的排列顺序及化合物具体结构,但是该方法通常需要较多的样品用于培养晶体,其培养时间和测试时间均较长,但随着光学和晶体解析软件的进步,其测试和解析时间越来越短,极大地提高了该技术的效率。而粉末衍射仪专门针对粉晶或混合物,可用来测定样品的物相组成,通过与特定数据库中特征峰形的对比,进而鉴定出其内在物质组成,也可通过使用对照品的内标法定量分析样品中的某一组分含量。粉末衍射法对样品要求较低,块状或粉末均可,并且其测试时间相对较短,数据分析也相对简单、快速。但是该方法也存在一定缺陷。首先,该方法使用X-射线对样品进行照射,有可能产生相应辐射,对环境和人体影响较大,需严格控制测试环境。其次,所需样品用量为毫克级,相对高效液相色谱法等其他分析方法用量较多。再次,由于该仪器的防护设施较大,占地较大并且价格相对高昂,限制了其推广和使用。

1.2 在化药中的应用

化合物经过不同的处理方法可以得到具有不同排列形式的晶型,并且同一药物的不同晶型在溶出度、熔点以及生物等效性方面会有显著差异,也会对药物的稳定性以及具体疗效产生不同的影响。2007年美国FDA发布《仿制药晶型研究的技术指导原则》,提出了评价多晶型质量检验标准的必要性。XRD可有效区分化合物分子结构或混合物特征信号,是物质结构表征的有效方法之一。

西咪替丁的晶体具有四种不同的晶型排列,由于这四种晶型的溶出情况不同,从而导致其实际疗效有一定区别。陈永康[3]等人通过不同的重结晶条件制备出了四种不同晶型的西咪替丁晶体,并通过相应实验和表征表明,A晶型物质在不同实验条件下的特征谱线基本吻合,温度、湿度以及光照等参数对该晶型物质的影响不大。而改变PXRD的电压、电流或扫描速度等测试条件,筛选出了信噪比高、扫描速度快、重现性好的最优测试条件,全方面论证了该晶型的稳定性。该测试方法可以用于原料药到制剂成品之间诸多处理环节的物质晶型变化监控,可以有效地分别该药品的变化情况,从而保证了药品的质量。

通常来讲,SCXRD(单晶X-射线衍射技术)是解析物质晶体结构的权威方法,但是生长出符合SCXRD尺寸和稳定性要求的晶体较为困难,而PXRD的数据能够解析出物质的相应结构而不受晶体培养的制约,逐渐成为SCXRD的有效补充及拓展。潘晴晴[4]等人比较了两种不同XRD测试灰黄霉素晶体的方法。根据测试数据对比,两种方法测得的晶胞参数最大相对偏差均小于0.5%,其键长键角数据也基本相符,不过,两者的键角和键长最大相对偏差分别为2.49%和4.19%,可能原因为使用的Rietvld模块精修功能较弱,导致实验结果出现偏差。随着PXRD技术的改进和处理方法的提升,PXRD可作为SCXRD的有力辅助工具,在有机小分子结构表征方面有着广泛的用途。

XRD也可以与其他检测方法共同使用,用于表征不同配方药品的物质结构,进而联合其他检测数据分析出最优的配方组成。顾念[5]等人通过扫描电子显微镜法SEM、PXRD以及差示扫描量热法(DSC)表征了他克莫司分散体的结构。经检测发现,他克莫司原料药在3°～20°有强的结晶衍射峰,辅料在此角度无特征衍射峰,而制剂分散体XRD图中仅存在辅料衍射峰,未出现原料药的结晶衍射峰,说明该药物分散体中不存在他克莫司晶体。由此可以推测,辅料能有效抑制他克莫司晶体的形成,导致在制剂中他克莫司是以无定形状态存在。罗雪玲[6]等人通过浸渍离心法制备了负载姜黄素的金纳米复合微粒,使用粒度分析仪、XRD、红外、热重等方法表征了该复合微粒的结构。在XRD图中,发现该金纳米微粒显示了四个特征衍射峰,峰形清晰且尖锐,表明复合微粒的晶化程度较高。通过实验,确定了该微粒的最大载药量,并优化了该纳米微粒的载药和缓释性能。苏文强[7]等人也通过XRD、DSC以及溶出法对姜黄素和半胱氨酸的混合物进行表征及测试,发现研磨法制备出的药物特征峰信号明显,并且没有新的衍射峰。结合溶出数据表明加液研磨并没有改变药物的晶型,该药物相对比较稳定。

XRD也可用于晶体的定量分析,通常为单峰法或全谱法。全谱法准确度高,但是很多药物暂时没有或者很难得到晶体结构文件(cif文件),其广泛使用受到一定限制,而单峰法对样品的信息要求较少,同时具有简便和灵敏等优点,适用于较多药品晶体定量分析情况,但是该方法需要纯度较高的对照品,同时该方法中样品的形态也会对准确度和重复性产生影响。楼永军[8]等人挑选了这两种晶型中的不同特征峰作为参照,通过PXRD建立了厄贝沙坦中晶型A和晶型B的定量分析方法。以特征峰的峰面积作为考察对象,开展了线性范围、检测限以及其他相关方法学验证实验,数据表明该方法专属性强,线性关系良好,为厄贝沙坦的晶型质量控制提供了有力的技术支撑。据报道,盐酸文拉法辛至少有6种晶型,而在实际生产中以晶型2为主。徐婷[9]等人以纯晶型作为标准物质,考察盐酸文拉法辛药品的稳定性。经PXRD检测和分析,发现该药物在48 h内组成稳定,其不同晶型的含量变化基本无偏差,证明该方法可广泛应用于不同晶型混合物的定量分析和结晶度的测定。

1.3 在中药中的应用

XRD在中药研究中也有较多的应用,可以鉴定中药配方中某一单体的真实结构,也可以用来分析中药配方的具体组成。时伟[10]等人以方解石的X射线衍射试验为例,分析单晶衍射SCXRD和粉末衍射PXRD的优劣。其结果显示:单晶衍射适合晶体尺寸较大、成分比较纯净的样品测定,而粉末衍射更适合晶体颗粒较小或成分不太纯净的样品,可有效地测定样品的成分和杂质组成。杨东爱[11]等人首次从土甘草中分离了土甘草A,生长出了该化合物的晶体并通过SCXRD进行结构表征,确定了土甘草A的分子构型和晶体结构。

徐旖旎[12]等人以载药量、包封率和收率为主要指标,使用扫描电镜、红外以及PXRD等表征仪器,确定了丹参酮IIA微球的最佳处方工艺。经XRD表征发现,样品的峰为二者简单叠加而成,在图中仍然存在药物晶体的信号,说明药物在该微球中仍然以晶体形式存在,同时也经红外信号分析,在红外图谱中未观测到新的信号峰,证实药物未与吸附材料发生化学反应。张立娟[13]等人利用XRF、PXRD以及FT-IR技术对广藿香的主要组分及微观结构进行测定,建立了鉴别中药材主要成分以及产地特征的新方法。实验结果表明,广藿香中含有K、Ca、P、Cl等元素,其独有的元素特征谱是广藿香道地药材鉴别的基础,同时也发现该药材含有大量的晶态物质及少量非晶态物质。该法联用XRF、PXRD以及FT-IR技术,从元素、原子以及分子层面表征了广藿香的主要成分和微观结构,避免了某种方法单独使用的缺陷,又避免了前处理的复杂工艺影响样品的原有特征,具有快速、简洁以及再现性好等优点,为中药材的质量控制和品质评价提供了新借鉴和参考。李燕华[14]报道了一种包含漆黄素的超分子体系,并利用核磁共振(NMR)、PXRD、DSC、SEM以及UV等技术对该包合物进行分析和表征。经PXRD检测,药物漆黄素与环糊精的包合物信号与单体有所区别,其衍射峰的强度较漆黄素单体显著减弱,而包合物本身的衍射峰有小部分环糊精的特征峰信号,可能原因为漆黄素与环糊精发生部分化学反应,使得XRD图存在差异。通过XRD等表征手段确定了漆黄素与环糊精衍生物的最佳比例,使得该药物的水溶性、热稳定性以及生物环境稳定性都得到了极大地提升。

中药配方颗粒是中药走向国际化、标准化的重要步骤,对其质量控制也显得尤其重要。XRD技术可在无损伤的条件下,直观反映药品的综合信息。矿物药也是中药和配方颗粒的重要组成,由于各个地区的环境不同以及制剂加工环节和方法不一,矿物药的成分和含量也有所区别。通过PXRD技术对矿物药进行表征,同时结合标准图谱进行比对,可以分析出矿物药的基本组成。王向丽[15]等人利用X-射线粉末衍射技术,优化了测试条件,对自然铜的组成进行表征和物相分析,并将其结果与标准图谱比对。测试结果表明,四种自然铜样品均含有二硫化铁和硫化亚铁,厂家A的配方颗粒和中药材样品中含有氧化铁,而另一厂家的药品中含有四氧化三铁。同时也发现,由于不同厂家生产配方颗粒的原料产地不同、生产炮制工艺及辅料添加,使得同种的配方颗粒测试结果以及中药材测试结果存在较大差异。同时,他们也应用了聚类分析法,对赤石脂、磁石、赭石进行PXRD的表征及物相分析,其实验结果也证实了这一点。

2 小结及展望

经过百年的发展,X-射线衍射技术得到了长久的进步和沉淀,已成为物质结构表征及解析的关键方法之一。随着新型光学技术和微电子技术的应用、解析软件的不断更迭,X-射线衍射技术在化学、生物学、药学及医学等众多领域得到了越来越广泛的使用,其检测效率更高,处理方法更为简单,检测结果更为全面和准确。在药学领域,不仅适用于化药的结构表征和定量分析,同时也能适用于中药和矿物药的组成分析。通过鉴定样品的晶型、晶胞以及特征峰信号等相关结构信息,结合其他相关的分析表征技术,可有效判断药物的有效成分及转变途径,判断药物的基本组成和真伪,探索药物制剂的最优制备方法和路径。但是相比其他表征技术而言,X-射线衍射技术也存在一些不足,例如晶体培养较为困难、定量分析仍需要标准品、所需样品量相对较大、测试时间较长、结构解析过程较为复杂、不能与其他设备联用。尽管如此,随着科技的发展和技术的提升,X-射线衍射技术在药学领域会有更为广阔的作为。