肿瘤靶向肽在多肽偶联药物中的研究进展

陈婉婷,郑仁林

(西南科技大学 生命科学与工程学院,四川 绵阳 621100)

肿瘤靶向治疗正在成为抗击癌症的一颗新星,靶向肽是一类靶向肿瘤细胞和组织的多肽,毒副作用小,可与抗癌药物偶联用于早期肿瘤病变部位的诊断和特异性给药,在治疗癌症方面有着良好前景。PDC将细胞靶向多肽与药物分子偶联起来,以增加药物分子的靶向性,将药物分子集中在目标组织,并降低在其他组织的相对浓度,进而提高药物的疗效并减少副作用[1]。作为肿瘤靶向载体,肿瘤靶向肽的优点很多,比如它易于合成,可以轻松引入结构修饰,支持合理的药物设计,提高稳定性、亲和力和生物利用率。此外,肿瘤靶向肽还具有低免疫原性。肿瘤靶向肽不仅可以与抗肿瘤药物偶联而起到靶向治疗肿瘤的作用,也可以与成像试剂和肿瘤诊断试剂偶联,以实现肿瘤显影和标记的目的。迄今,人们已经对多肽偶联药物有相当多的报道,然而,肿瘤靶向肽在多肽偶联药物中的使用相关的详细报道尚很少见。本文综述了肿瘤靶向肽在多肽偶联药物中的研究进展,详细介绍了肿瘤靶向肽的筛选方法、分类以及已上市多肽偶联药物使用的靶向肽。

1 肿瘤靶向肽的筛选方法

肿瘤靶向肽可以对肿瘤的血管和肿瘤的相关受体进行特异性的识别,然后实现其靶向性。不断发展的抗肿瘤研究技术,让很多靶向肿瘤的肽被发掘出来。目前主要有三种方法对肿瘤靶向肽进行筛选:噬菌体展示技术、化学合成肽库筛选、计算机模拟设计肿瘤特异性靶点。

1.1 噬菌体展示技术筛选

噬菌体展示技术筛选目标多肽的基本原理是将指定多肽一段基因序列插入到噬菌体的基因序列中,让植入外源基因的噬菌体感染细菌,多次转染筛选及淘汰、洗脱扩增后得到通过噬菌体表达的目标多肽。

固相与肽库的靶蛋白分子经过一段时间的孵育后,会产生未结合的游离噬菌体被洗去,然后竞争受体或酸洗脱与靶分子吸附的噬菌体,洗脱的噬菌体感染宿主细胞,经过繁殖扩增,再进行下一轮的洗脱,一个“吸附-洗脱-扩增”的过程就产生了。与靶分子特异性结合的噬菌体,经过3～5轮的“吸附-洗脱-扩增”,得到高度浓缩。由此产生的噬菌体制剂可用于进一步富集具有所需结合特性的目标多肽。这种从组合库中高通量筛选特定噬菌体和提取多肽的方法,对研究多肽对肿瘤细胞的亲和力很有帮助,应用较为广泛。

1.2 化学合成肽库筛选

化学合成肽库(Synthetic Peptide Library)是以化学合成法随机合成特定长度的多肽集合。由组成多肽的氨基酸数量决定库容量大小的20种天然氨基酸,可作为合成肽库时的构建单元。化学合成肽库与生物合成肽库相比,其优点在于氨基酸构成肽,可以是非天然氨基酸。

各种偶联缩合剂和固相多肽合成仪的发展使研究人员能够获得大量不同序列的短肽,这些肽一般由4～12个非天然或天然构型的氨基酸组成。通过修饰氨基酸、改变氨基酸的序列顺序、替换氨基酸等方法,能够构建大量的多肽化合物库,获得多肽后再建立适合的亲和色谱体系,以测定优先序列和先导序列的表观解离常数,经过优化和筛选,可以得到对配体具有高亲和力的短肽[2]。Teerapat Ananuchatkul等人利用化学修饰方法设计的肽库通过添加人工功能团进行修饰而得到扩展。他们利用噬菌体展示和化学修饰相结合的方法,创建了一个吻合器α-螺旋肽库,其结构受短链连接处的限制,从而推动了一项发现具有高亲和力和特异性的肽配体。不复杂的多肽固相合成和高纯度的产物,可以通过人工修饰得到多种非天然多肽,这提供了一个珍贵的多肽化合物库,以找到适合的肿瘤靶向多肽。

1.3 计算机辅助肽设计

结构生物学研究发现,许多没有固定形态的蛋白质通过含有柔性肽段的肽识别域(Peptide-recognition Domain)与靶标蛋白结合,介导瞬时可逆的动态蛋白-蛋白之间的相互作用。蛋白质组学和基因组学的迅速发展积累了大量的序列信息和结构数据,仅靠人工实验方法加工处理这些信息成本较高、耗时耗力。计算机辅助肽设计(Computer Aided Peptide Design)应运而生,它在充分发挥计算机人工智能、图形处理和数据挖掘等技术作用的基础上,结合分子动力学模拟、分子对接和定量构效关系等方法,将合理的药物设计过程与计算机辅助设计技术相结合,为多肽设计提供高效合理的理论指导。在结合肿瘤靶点时,肿瘤靶点肽和肿瘤靶点有关键的锚定残基。研究人员开发了一系列计算机模拟计算软件,能够根据蛋白质结构库(Protindbank,PDB)提供的肿瘤靶点的蛋白质晶体结构分析蛋白质与多肽作用力,并利用模拟计算获得配体与受体相互作用力的能量、类型、氨基酸残基制程之间的距离等信息,通过分析大量肿瘤靶点与非靶点的数据,设计出一系列靶向多肽,筛选出更优秀的多肽。

2 肿瘤靶向肽分类

研究表明,肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞表面的各种受体的表达状态与正常细胞有所不同[3]。此外,肿瘤微环境在有氧呼吸、血管生成及代谢状态等方面与正常组织有明显差异。具体表现为酸中毒、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)表达异常、基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,MMP)表达异常等[4]。因此,在肿瘤细胞表面、肿瘤血管内皮细胞表面和肿瘤微环境中具有高表达受体的配体多肽对肿瘤组织具有天然的靶向性。此外,还有许多多肽对细胞中的各种亚细胞器也具有靶向性,如核定位信号肽[5]和线粒体靶向肽[6]。当细胞毒性药物与这些靶向肽结合后,就可以被靶向传递到肿瘤组织中,从而提高药物的疗效和生物利用度,有效避免对正常细胞的损害,降低药物的全身系统毒性(Systempoxicalpoxide)。

2.1 肿瘤细胞靶向肽

靶向肿瘤细胞多肽的受体往往高度表达在肿瘤细胞表面,如促性腺激素释放激素受体(GNRHR)、表皮生长因子受体(EGFR)、胰岛素样生长因子受体(IGF-IR)等。通过靶向肿瘤细胞表面受体的靶向肽对载体材料进行化学修饰,通过包裹药物制造的PDC,以及患者对药物的适应性,有效提高细胞毒性药物的临床疗效和安全性,从而达到直接靶向肿瘤细胞的目的[7]。

Pham等利用转肽酶A和一种蛋白连接酶在人类红细胞外囊泡与EGFR靶向肽之间建立共价键进行偶联,促进了体内EGFR阳性肺癌细胞对RBCEVs的特异性摄取[8]。此外,将EGFR靶向肽与包载着紫杉醇(Paclitaxel,PTX)的细胞外囊泡偶联,显著增强了该药物抑制EGFR阳性肿瘤生长的功效。

2.2 肿瘤血管靶向肽

肿瘤生长和增殖、侵袭和转移对营养的需求较高,在结构和功能上与正常血管不同。因此,肿瘤靶向治疗的一种有前景的策略是以肿瘤内皮细胞为靶点,向肿瘤组织输送药物,避免损伤正常组织。

在血管靶向肽中,研究最多的是能识别肿瘤内皮细胞上表达的V3和V5整合素的RGD肽和NGR肽,它们与整合素发生交联,进而将目标锁定在肿瘤血管上。在肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞上,整合素分子仅在正常细胞上有微量的表达。NGR肽能识别并与多种肿瘤血管内皮细胞过度表达、对肿瘤选择性较好的氨基肽酶N(又称CD13)结合。通过与药物偶联血管靶向肽,实现主动的药物靶向。当RGD肽(GSSSGRGDSPA)与PEG修饰过的硬脂酸胶束耦合时,通过表达整合素的肿瘤会增加对其的摄取量,从而使胶束携带的药物更多地进入肿瘤细胞。也有研究用C(RGDyK),即环状RGD肽,将含有疏水性化疗药物的胶束输送给癌细胞,使其过度表达整合素。也有报告指出,NGR肽与铂类抗癌药的耦合,使肿瘤具有更强的定位和结合性。在脂质上的PEG末端附着NGR和STR-R4肽,促使CD13阳性细胞摄取胶质体[9]。

2.3 细胞器靶向肽

细胞器的独特生理功能对细胞核、线粒体等细胞器可作为肿瘤治疗的目标,对肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭和转移起着至关重要的作用。细胞核(Cellnuclear)是真核细胞中重要的细胞结构,是细胞遗传与代谢调节的核心。将药物靶向到细胞核,可以克服耐药细胞的外排作用,有效地破坏肿瘤细胞核的结构和功能,造成生理紊乱和细胞凋亡。然而,细胞核外的核膜抑制了细胞核与细胞质的物质运输,而大分子活性物质进入细胞核需要核靶向分子。细胞核靶向肽可以成功地将细胞毒性药物运送到细胞核中,被广泛用于协助药物进入细胞核。

线粒体是细胞代谢和有氧呼吸的主要场所,为细胞代谢提供能量。传统线粒体靶向肿瘤治疗由于传统线粒体靶向药物系统对肿瘤细胞选择性低、肿瘤细胞富集少、全身系统毒性较高等缺点,削弱了肿瘤治疗效果,因此采用亲脂阳离子(如三苯基)作为线粒体靶向基团向线粒体递送细胞毒性物质。线粒体靶向肽为了克服这些缺点,通常包含线粒体穿膜肽、Szeto-Schiller肽、线粒体靶向序列[10]等带有正电荷和疏水性的氨基酸,并被提出取代线粒体靶向分子的亲脂性阳离子。受损的线粒体会产生激活CASPASE家族蛋白以启动细胞凋亡的信号,例如活性氧和细胞色素C。所以线粒体是最合适的通过肿瘤光动力治疗(Photo Dynamic Therapy,PDT)引发细胞凋亡的细胞器。Sun等人[11]以RGD肽和KLA肽开发了一种多阶段肿瘤靶向脂质体(RGD/KLA-modified liposome,RGD-KLA-Lip)负载紫杉醇(Paclitaxel,PTX),RGD-KLA-Lip具有对肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞线粒体的靶向运输作用,促进线粒体介导的细胞凋亡,有效降低细胞毒性药物的全身系统毒性。

2.4 细胞穿膜肽

细胞穿透肽(Cell-penetratingpeptide,CPP)通常由30个以下的氨基酸组成,主要是碱性氨基酸,是一类能穿透肿瘤细胞的肽类。按有无靶向性分为两类:以TAT为代表的非靶向穿透肽和以iIRGD为代表的靶向穿透肽。

2.4.1 非靶向穿透肽

TAT蛋白转导肽是由人类免疫缺陷病毒(Human immun odeficiency virus typel)组成的具有正电的富含碱性氨基酸的多肽,由HIV-1编码。研究发现,其全长序列和11个碱性氨基酸富集区的核心肽段(YGRKRQRRR),能携带这些外源生物大分子穿透活体细胞的各种生物膜性结构(细胞膜和血脑屏障等),进入胞内发挥生理功能,在包括蛋白质、多肽和核酸在内的多种外源生物大分子跨膜转导过程中发挥着重要作用,但跨膜传递的机理尚待明确。

2.4.2 靶向穿透肽

靶向穿透肽的作用是既能针对目标,又能穿透膜。在肿瘤血管生成过程中,具有RGD(Argine-Glycine-Aspartic,精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸)序列的肽能有效诱导内皮细胞选择性地将整合素受体大量表达出来,使之与αvβ3受体结合在肿瘤内皮细胞上。经RGD靶向肽修饰的纳米载体已证实可向肿瘤斑块血管传递药物、SIRNA、造影剂等[12]。但肿瘤靶向治疗的主要障碍是肿瘤血管靶向仅在肿瘤血管内和肿瘤血管周围聚集药物载体,如何有效地将药物载体穿透血管壁进入肿瘤本质。

2.5 肿瘤微环境敏感肽

肿瘤微环境由免疫细胞、基质细胞、肿瘤细胞和细胞外间质组成,在有氧呼吸、血管生成和代谢状态方面与正常组织有明显不同。肿瘤微环境的主要生理特征包括微酸度、细胞内外巯基物质的不同浓度、部分酶的过度表达和低氧。因此,肿瘤微环境和正常细胞之间的主要差异为肿瘤靶向治疗提供了更多有效的靶点选择。在众多的肿瘤微环境响应肽中,酶敏感、pH敏感[13]和还原敏感的肽已被研究人员广泛使用。例如,MMP家族参与人体重要的生理和病理过程,在正常组织中少量存在,但在肿瘤微环境中可高度表达,对肿瘤细胞转移和侵袭有重要作用。

Qiu等[14]利用含有MMP-2敏感多肽GPLGLAG的可活化细胞穿膜肽(Activatable Cell-penetrating Peptide,ACPP)作为桥梁,在金纳米棒(Gold Nanorods,GNRs)表面修饰原啉IX(PPIX),得到GNR-ACPP-PIX纳米给药系统。由于ACPP独特的U型结构和GNR强烈的近红外区光吸收,PpIX的光活性被抑制。当纳米系统到达肿瘤组织时,嵌合肽的GPLGLAG肽序列被MMP-2降解,使PEG外壳脱落,细胞穿膜肽暴露,PPIX的光活性得以恢复,从而促使光敏剂富集于过度表达MMP-2的肿瘤细胞。

2.6 治疗肽

肿瘤抗原通过人体白细胞抗原(Human Leukocyfe Antigen,HLA)输送到免疫系统中,由抗原递呈细胞(APC)摄取和处理肿瘤抗原,并将抗原输送到T淋巴细胞中的一类免疫细胞中,使免疫系统区分出正常细胞和肿瘤细胞。从而造成免疫反应。因此,肿瘤抗原多肽尤其是只在肿瘤细胞表达的肿瘤特异性表达抗原肽均可作为免疫治疗肽,在以APC和T淋巴细胞为靶点对肿瘤细胞进行免疫治疗方面有着巨大潜力。

Bo⊇l等人[15]报道了一个编码肿瘤抗原的新基因BAGE,其编码的ARAVFLAL肽可被T淋巴细胞识别。BAGE 基因在正常组织中沉默,在肿瘤部位特异性表达,编码的抗原作为细胞毒性T淋巴细胞的靶向肽,引发免疫系统对肿瘤的免疫应答。

3 已上市PDC药物使用的靶向肽

目前FDA批准的用于临床癌症治疗的PDC只有两种:Melflufen和177Lu-Dotatate。

3.1 Melflufen:靶向氨肽酶的多肽

2021年2月27日,美国食品和药物管理局(FDA)批准了Oncopeptides公司研发的用于治疗复发和难治性多发性骨髓瘤(RRMM)的melflufen(PEPAXTO®)。Melflufen在总体人群中的总响应率(Overall Response Rate,ORR)为29%,在三级难治性MM患者中的ORR为26%。该药物将烷基化剂与靶向氨基酶的多肽偶联起来,是一种亲脂性二肽的乙基酯化物,由美法兰和对氟-L-苯丙氨酸组成。由于其亲脂性,melphalan flufenamide可迅速穿过细胞膜,并几乎立即被细胞质中的氨基肽酶水解,产生更多的亲水烷基分子,如melphalan和desethl-melflufen。所有人类细胞中都存在氨肽酶,并过度表达于包括多发性骨髓瘤在内的各种肿瘤中。

3.2 Lutathera:生长激素抑制素

2018年1月26日,由诺华公司研制出的Lutathera(Lutetium Lu 177 dotatate;Advanced Accelerator Applications)注射液获得FDA批准上市,是一种放射性标记的体肽类似物,用于治疗体肽受体阳性的GEP-NETs成人患者,包括前中后肠的NETs。

177Lu-dotatate是根据第三阶段NETTER-1研究的结果而被批准的。在这项研究中,转移性中肠神经内分泌的肿瘤患者每8周接受一次177Lu-dotatate(总剂量为四次)与奥曲肽LAR联合使用,与单独使用LAR相比,在PFS、ORR和OS( Overall Survival,总生存期)方面均有明显优势。177Lu-Dotatate利用生长激素抑制素作为靶向多肽,结合放射性元素177Lu,在80%以上的高分化神经内分泌肿瘤中表达出生长抑素受体,从而为将生长抑素类似物作为PDC的归巢肽提供了理想的靶点。

4 结论

随着噬菌体展示技术、多肽固相合成技术和计算机辅助多肽设计等技术的快速发展,越来越多的新型肿瘤靶向多肽偶联药物被开发出[16]。靶向多肽因其多重优势而被广泛用于早期癌症检测、癌症靶向治疗和肿瘤治疗剂的合成。然而,特异性强、毒性较小的多肽的高效筛选、靶向多肽药物的作用机制和临床应用,以及寻找更有效的靶点,是需要不断研究的问题。