经典名方甘草泻心汤基准样品的量值传递研究

王孟缘，霍 然，于孟涵，徐 伟，邱智东，邱 野

经典名方甘草泻心汤基准样品的量值传递研究

王孟缘，霍 然，于孟涵，徐 伟，邱智东，邱 野*

长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117

建立经典名方甘草泻心汤（Gancao Xiexin Decoction，GXD）基准样品的HPLC图谱及指标性成分含量测定方法，研究GXD基准样品量值传递规律。制备15批GXD基准样品，建立特征图谱并选用《中药色谱指纹图谱相似度评价》软件进行相似度评价，明确特征峰并对其进行归属。测定指标性成分甘草苷、甘草酸、黄芩苷、盐酸小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀的含量，计算指标成分转移率，分析指标成分在饮片-基准样品中量值传递的规律。15批GXD基准样品指纹图谱相似度均大于0.90，共指认22个共有峰，甘草5个、黄芩5个、甘草和黄芩共有3个、黄连6个、黄芩和黄连共有2个、干姜1个；各指标成分从药材-饮片平均转移率分别为98.69%、98.13%、96.94%、94.59%、91.76%、88.08%、94.16%；饮片-基准样品平均转移率为49.08%、42.24%、28.34%、26.72%、29.32%、33.62%、47.93%。特征图谱与多指标成分含量测定方法相结合，对GXD药材-饮片-基准样品的量值传递过程进行分析研究，为经典名方GXD制剂开发提供参考。

经典名方；甘草泻心汤；基准样品；特征图谱；甘草苷；甘草酸；黄芩苷；盐酸小檗碱；表小檗碱；黄连碱；巴马汀；量值传递

经典名方，承载着中医药理论，体现了古人的智慧，以“组方魅力，加和效应”的特点体现了中医药特色理论知识。近年来，国家一直出台多项政策，鼓励经典名方研究，本实验研究的经典名方甘草泻心汤（Gancao Xiexin Decoction，GXD）是国家中医药管理局公布的《古代经典名方目录（第一批）》第11号方剂。GXD出自东汉张仲景《伤寒论》[1]，原文记载：甘草（炙四两）、干姜（三两）、黄芩（三两）、半夏（洗，半升）、大枣（擘，十二枚）、黄连（一两）。以水一斗，煮取六升，去滓，再煎取三升，温服一升，日三服。GXD组方严谨，全方药材一温一寒，一补一泻，辛开苦降，益气和胃，是张仲景治疗脾胃虚热的经典方剂。随着中医药的发展，现代医家遵循异病同治的原则，将GXD扩展应用于白塞病、复发性口腔溃疡、反流性食管炎、寒热交错导致的溃疡性结肠炎等多种疾病[2-3]，GXD制剂研究具有良好的发展前景。

调查发现GXD的临床应用和药理研究较多，质量控制研究较少，极少部分为单味药材炙甘草的研究[4]，缺乏GXD整体的指纹图谱及含量测定研究，为了推进GXD复方制剂的进一步研究应用，本实验遵循《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报资料要求》[5]，查阅古籍文献，确定处方剂量[6]，还原出GXD的基准样品制备方法，开展对GXD指纹图谱及多指标成分含量测定研究。本研究通过测定15批GXD基准样品指纹图谱、指标成分的含量及出膏率，探究甘草苷、甘草酸、黄芩苷、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱等指标成分在药材-饮片-基准样品的传递规律，初步建立了GXD基准样品的质量控制标准，为后续GXD在制剂方面的深入研究提供借鉴和科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；MS105DU型十万分之一电子分析天平、EL204型万分之一电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KQ-500B型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；FTS-40B型分体黑陶壶，潮州壶百饮电器实业有限公司；DK-98-II型电热恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；FDU-1200型冷冻干燥机，上海政泓实业有限公司。

1.2 试剂与试药

1.2.1 试剂 色谱纯乙腈、甲醇，美国Fisher公司；分析纯甲醇，北京化工厂；实验用水为纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司。

1.2.2 对照品 甘草苷（批号111610-202008，质量分数95%）、甘草酸（批号110731-202021，质量分数96.2%）、黄芩苷（批号111715-202122，质量分数94.2%）、汉黄芩苷（批号111514-201706，质量分数98.5%）、盐酸小檗碱（批号110713-202015，质量分数85.9%）、姜辣素（批号111833-202007，质量分数99.3%）、盐酸巴马汀（批号110732- 201913，质量分数85.7%），中国食品药品检定研究院；表小檗碱（批号B20108，质量分数98%）、盐酸黄连碱（批号B20560，质量分数98%），上海源叶生物科技有限公司；槲皮素（批号SQ8030，质量分数98%），索莱宝科技有限公司。

1.2.3 药材信息 GXD各味药材总批数均为15批，药材产地信息见表1（字母为地区名称缩写），经长春中医药大学中药鉴定教研室翁丽丽教授鉴定，甘草为豆科甘草属植物甘草Fisch.的干燥根和根茎、半夏为天南星科半夏属植物半夏(Thunb.) Breit.的干燥块茎、黄芩为唇形科黄芩属植物黄芩Georgi.的干燥根、黄连为毛茛科黄连属植物黄连Franch.的干燥根茎、干姜为姜科姜属植物姜Rosc.的干燥根茎、大枣为鼠李科枣属植物枣Mill.的干燥成熟果实。遵循《中国药典》2020年版项下规定，对药材进行检验，药材合格。结合前期古籍考证及研究，甘草（炙）为炒甘草，半夏（洗）汤洗半夏，并将药材炮制并检验，饮片均符合《中国药典》2020年版的相关要求。

2 方法与结果

2.1 GXD基准样品的制备

将单味药各批饮片通过Excel中Randbetween函数随机组合制备GXD，各批次组合具体信息见表2。GXD原方记载：甘草四两、干姜三两、黄芩三两、半夏半升、大枣十二枚、黄连一两，以水一斗，煮取六升，去滓，再煎取三升，温服一升。《伤寒论》中汉1合约为20 mL左右，1升为200 mL，半夏1升＝84 g相接近。但半夏有毒，半升42 g远远超过了方中其它药味的用量，这与配伍原则不符，参考《经典名方开发指引》与近几版的《方剂学》教材及现代名家应用都以东汉一两为3 g，半夏半升＝12 g为主，本研究半夏也采用较为合理的12 g[6-8]。综上，折算后取炒甘草12 g，黄芩9 g，干姜9 g，大枣12 g，半夏12 g，黄连3 g，于3 L砂锅中，加水2000 mL，采用电加热方式，武火（2000 W）煎至沸腾，文火（800 W）开盖煎煮160 min（煎至滤液为1200 mL），200目绢布趁热过滤，继续煎煮55 min（煎至滤液约为600 mL），冷冻干燥，即得GXD基准样品的冻干粉。称定质量，计算出膏率。

表1 15批GXD基准样品药材组合信息

Table 1 Combination information of 15 batches of GXD benchmark herbs

甘草批号产地黄芩批号产地干姜批号产地 GLH-20210428甘肃陇西SJX-20210401山西稷山NLB-20201009云南曲靖 GLS-20210529甘肃陇西SJX-20210402山西稷山NLM-20201010云南曲靖 NCX-20210722内蒙古赤峰SWG-20210404山西万荣NLD-20201011云南曲靖 NCX-20210721内蒙古赤峰SWD-20210405山西闻喜NLT-20201012云南曲靖 NCX-20210805内蒙古赤峰SWX-20210406山西闻喜NLF-20201013云南曲靖 NCN-20210807内蒙古赤峰SHX-20210319陕西韩城SCC-20201015山东临沂 NCN-20210811内蒙古赤峰SHZ-20210320陕西韩城SCX-20201016山东临沂 NCN-20210809内蒙古赤峰SHS-20210321陕西韩城SCS-20201017山东临沂 XYJ-20210826新疆和田SHB-20210322陕西韩城SCJ-20201018山东临沂 XME-20200919新疆和田SHL-20210323陕西韩城SCB-20201019山东临沂 XHY-20210306新疆和田SHJ-20210324陕西韩城SCD-20201020四川乐山 NCN-20210329内蒙古赤峰GQN-20210405甘肃庆阳SLT-20201018四川乐山 GLK-20210326甘肃陇西GQN-20210406甘肃庆阳SLT-20201019四川乐山 GCW-20210327甘肃陇西GQN-20210407甘肃庆阳SLT-20201020四川乐山 GLS-20210329甘肃陇西GQN-20210408甘肃庆阳SLT-20201021四川乐山 黄连批号产地半夏批号产地大枣批号产地 CSL-20201012重庆石柱HAZ-20200912河北安国XHY-20210310新疆哈密 CSL-20201013重庆石柱HAZ-20200913河北安国XHY-20210311新疆哈密 CSF-20201012重庆石柱HAD-20200921河北安国XHY-20210312新疆哈密 CSL-20201015重庆石柱HAD-20200922河北安国XHY-20210313新疆哈密 CSW-20201020重庆石柱HAD-20200923河北安国XHY-20210314新疆哈密 SEL-20201017四川峨眉山HAD-20200924河北安国XHY-20210315新疆哈密 SES-20201017四川峨眉山GLN-20200905甘肃陇西XBR-20201009新疆巴州 SEL-20201020四川峨眉山GLX-20200920甘肃陇西XBR-20201010新疆巴州 SEL-20201018四川峨眉山GLX-20200921甘肃陇西XBR-20201011新疆巴州 SEJ-20201017四川峨眉山GMM-20200901甘肃陇西XBR-20201015新疆巴州 CLB-20201016四川成都GMM-20200902甘肃陇西XBR-20201018新疆巴州 CLB-20201017四川成都AQC-20201001安徽亳州XMR-20201015新疆墨玉 CLB-20201018四川成都AQC-20201002安徽亳州XMR-20201016新疆墨玉 CLB-20201019四川成都AQC-20201003安徽亳州XHH-20201009新疆和田 CLB-20201020四川成都AAH-20200907安徽安庆XHM-20901010新疆和田

出膏率＝1个处方量的冻干粉质量/1个处方量的饮片质量

同法制备单味饮片及缺单味饮片阴性样品。

2.2 GXD基准样品指纹图谱的建立

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取甘草苷、甘草酸、黄芩苷、汉黄芩苷、盐酸小檗碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、槲皮素、姜辣素、盐酸巴马汀对照品适量，加70%甲醇配制成质量浓度分别为47.0、226.6、60.8、46.7、11.1、5.1、10.6、43.0、50.0、94.8 μg/mL的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称定GXD冻干粉0.2 g，精密加入10 mL 70%甲醇，称定质量，超声30 min（40 kHz、500 W）冷却后称定质量，用70%甲醇补足缺失的质量，滤过，取续滤液过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

表2 15批GXD基准样品药材组合信息及出膏率

Table 2 Combination information and paste yield of 15 batches of GXD benchmark herbs

编号炒甘草半夏黄芩黄连干姜大枣出膏率/% S1GLH-20210428HAZ-20200912SJX-20210401CLB-20201016NLB-20201009XHY-2021031030.76 S2GLS-20210529HAZ-20200913SJX-20210402CLB-20201017NLM-20201010XHY-2021031130.59 S3NCX-20210722HAD-20200921SWG-20210404CLB-20201018NLD-20201011XHY-2021031229.98 S4NCX-20210721HAD-20200922SWD-20210405CLB-20201019NLJ-20201012XHY-2021031328.34 S5NCX-20210805HAD-20200923SWX-20210406CLB-20201020NLF-20201013XHY-2021031431.47 S6NCN-20210807HAD-20200924SHX-20210319CSL-20201013SCC-20201015XHY-2021031528.09 S7NCN-20210811GLN-20200905SHZ-20210320CSL-20201015SCX-20201016XBR-2020100927.97 S8NCN-20210809GLX-20200920SHS-20210321CSW-20201020SCS-20201017XBR-2020101026.63 S9XHY-20210326GLX-20200921SHB-20210322SEJ-20201017SCJ-20201018XBR-2020101131.42 S10GLK-20210326GMM-20200901SHL-20210323SEL-20201017SCB-20201019XBR-2020101529.67 S11NCN-20210329GMM-20200902SHJ-20210324SEL-20201018SCD-20201020XBR-2020101831.11 S12GLS-20210329AQC-20201001GQN-20210406SEL-20201020SLJ-20201018XMR-2020101528.33 S13GLW-20210327AQC-20201002GQN-20210407SES-20201017SLJ-20201019XMR-2020101627.91 S14XYJ-20200826AQC-20201003GQN-20210408CSL-20201012SLJ-20201020XHH-2020100926.48 S15NCN-20210809AAH-20200907GQN-20210409CSF-20201012SLJ-20201021XHM-2020101031.10

2.2.3 色谱条件 色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱：0～10 min，19%乙腈；10～18 min，19%～21%乙腈；18～34 min，21%～24%乙腈；34～40 min，24%～26%乙腈；40～50 min，26%～29%乙腈；50～60 min，29%～36%乙腈；60～70 min，36%～44%乙腈；70～80 min，44%～52%乙腈；80～85 min，52%～71%乙腈；85～95 min，71%～19%乙腈；95～110 min，19%乙腈；体积流量为0.8 mL/min；检测波长237 nm；柱温25 ℃；对照品溶液及供试品溶液进样量均为10 μL。

2.2.4 精密度考察 取编号S1供试品溶液，按“2.2.3”项色谱条件连续测定6次，以黄芩苷为参照峰（黄芩苷峰面积稳定，分离度优，无拖尾），计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果24个共有峰相对保留时间的RSD＜1.0%，相对峰面积的RSD＜4.0%，表明该方法精密度良好。

2.2.5 重复性试验 取S1基准样品按“2.2.2”项下制备供试品溶液6份，按“2.2.3”项下色谱条件测定，以黄芩苷为参照峰，计算共有峰相对保留时间的RSD＜1.0%，相对峰面积的RSD＜3.0%，表明方法重复性良好。

2.2.6 稳定性试验 取S1供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样后测定，以黄芩苷为参照峰，计算得出共有峰相对保留时间的RSD＜1.0%，相对峰面积的RSD＜5.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.7 指纹图谱建立及相似度评价 将15批GXD基准样品供试品溶液（S1～S15），按“2.2.3”项下色谱条件测定，记录色谱图并导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件中，生成叠加图（图1），以S1为参照图谱，时间窗宽度0.1 s，设置中位数法，Marker峰匹配，并生成对照图谱（R），以相似度评价系统计算，得到15批GXD基准样品（S1～S15）与R的相似度结果分别为0.956、0.929、0.922、0.965、0.943、0.980、0.968、0.976、0.966、0.967、0.982、0.933、0.943、0.929、0.969，结果表明，不同批次间差异较小，GXD基准样品制备工艺较为稳定。

将GXD基准样品指纹图谱进行特征峰归属，全方共有22个共有峰，同对照品相比共指认10个色谱峰，其中2（甘草苷）、7（表小檗碱）、8（盐酸黄连碱）、10（黄芩苷）、11（盐酸巴马汀）、12（盐酸小檗碱）、15（槲皮素）、16（汉黄芩苷）、19（甘草酸）、21（姜辣素）号峰，混合对照品及GXD基准样品特征图谱见图2。

对比单味饮片样品、缺单味饮片阴性样品和GXD基准样品对照图谱，对各特征峰进行归属分析，结果见图3、4。结果表明，1、2（甘草苷）、18、19（甘草酸）、20号峰来源于甘草，4、10（黄芩苷）、13、14、16（汉黄芩苷）号峰来源于黄芩，9、15（槲皮素）、17号峰为甘草、黄芩共有，5、6、7（表小檗碱）、8（盐酸黄连碱）、11（盐酸巴马汀）、12（盐酸小檗碱）号峰归属黄连，3、22号峰为黄芩、黄连共有，21（姜辣素）号峰归属于干姜。大部分色谱峰归属清晰，饮片中物质群可以稳定传递到基准样品中。

图1 15批GXD基准样品HPLC叠加指纹图谱和对照指纹图谱(R)

2-甘草苷 7-表小檗碱 8-盐酸黄连碱 10-黄芩苷 11-盐酸巴马汀 12-盐酸小檗碱 15-槲皮素 16-汉黄芩苷 19-甘草酸 21-姜辣素

2.3 15批GXD基准样品出膏率及出膏转移率考察

按“2.1”项下分别制备15批GXD各单味饮片及全方水煎液，冻干后记录质量，计算单味饮片及基准样品的实际出膏率，结果见表3。全方含有甘草12 g，黄芩9 g，干姜9 g，大枣12 g，半夏12 g，黄连3 g，总计57 g。理论出膏率应为单位药折算。

理论出膏率＝0.210×对应批次甘草饮片的出膏率＋0.053×对应批次黄连饮片的出膏率＋0.210×对应批次半夏饮片的出膏率＋0.160×对应批次黄芩饮片的出膏率＋0.160×对应批次干姜饮片的出膏率＋0.210×对应批次大枣饮片的出膏率[9]

实际出膏率＝冻干粉质量/各饮片取样量[9]

转移率＝全方实际/全方理论[10]

变化幅度＝(全方理论－全方实际)/全方理论[10]

结果显示，15批GXD基准样品的实际出膏率为28.09%～30.76%，均值为29.48%，皆在均值的70%～130%（20.64%～38.32%），未出现离散数据；理论出膏率为31.28%～34.44%，均值为33.16%，皆在均值的70%～130%（23.21%～43.11%），未出现离散数据；整体理论出膏率高于实际出膏率，平均出膏率转移率为88.94%，出膏率的变化幅度为7.59%～16.75%，满足经典名方研究技术指导原则，显示出经典名方GXD煎煮工艺的稳定可行，以实际出膏率均值的70%和130%作为上下限，故建议GXD基准样品出膏率在20.64%～38.32%。

图3 GXD基准样品与单味药对照图谱

图4 GXD基准样品与各单味药阴性样品对照图谱

表3 GXD基准样品出膏率及转移率结果

Table 3 Results of paste yield rate and transfer rate of GXD benchmark samples

编号实际出膏率/%理论出膏率/%转移率/%变化幅度/%编号实际出膏率/%理论出膏率/%转移率/%变化幅度/%编号实际出膏率/%理论出膏率/%转移率/%变化幅度/% S130.7633.3092.377.63S628.0933.3984.1415.86S1130.1132.9091.528.48 S230.5934.4488.8111.19S728.9731.6791.488.52S1228.3333.0285.7914.21 S329.9832.8991.158.85S828.6333.5185.4414.56S1328.9131.2892.417.59 S428.7433.1686.6713.33S930.4233.3391.268.74S1428.4834.2183.2516.75 S530.4733.0792.157.85S1029.6733.6288.2511.75S1530.1033.6589.4510.55

2.4 GXD基准样品中多成分含测方法建立

2.4.1 色谱条件

（1）甘草苷和甘草酸定量色谱条件：色谱柱为Agilent Zorbax SB-Aq柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.05%磷酸水溶液-乙腈；梯度洗脱：0～8 min，19%乙腈；8～35 min，19%～50%乙腈；35～36 min，50%～70%乙腈；36～40 min，70%乙腈；40～41 min，70%～19%乙腈；41～50 min，19%乙腈；体积流量1 mL/min；柱温25 ℃；波长237 nm；进样量10 μL；HPLC图见图5。

（2）黄芩苷定量色谱条件：色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.2%磷酸水溶液-乙腈；梯度洗脱：0～20 min，19%～21%乙腈；20～34 min，21%～24%乙腈；34～35 min，24%～60%乙腈；35～38 min，60%～19%乙腈；38～45 min，19%乙腈；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长280 nm；进样量10 μL；HPLC图见图6。

图5 甘草苷和甘草酸含量测定HPLC图

图6 黄芩苷含量测定HPLC图

（3）表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱定量色谱条件：色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾水溶液（50∶50）为流动相，等度洗脱：0～25 min，100%乙腈；体积流量1 mL/min；柱温35 ℃；检测波长345 nm；进样量10 μL；HPLC图见图7。

2.4.2 供试品溶液的制备

（1）甘草苷和甘草酸的测定：精密称取GXD基准样品冻干粉0.3 g，置具塞锥形瓶中，加入70%乙醇10 mL，密塞，称定质量，超声30 min，冷却后补足减失的质量，摇匀，取续滤液，即得。

图7 表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱含量测定HPLC图

（2）黄芩苷的测定：精密称取GXD基准样品冻干粉0.56 g，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇10 mL，密塞，称定质量，超声30 min，冷却后补足减失的质量，摇匀，取续滤液，即得。

（3）表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱的测定：精密称取GXD基准样品冻干粉0.4 g，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇10 mL，密塞，称定质量，超声30 min，冷却后补足减失的质量，摇匀，取续滤液，即得。

2.4.3 对照品溶液的制备

（1）甘草苷和甘草酸：精密称取甘草苷、甘草酸铵对照品适量，加入70%乙醇溶解，制得质量浓度分别为甘草苷929.1 μg/mL、甘草酸906.204 μg/mL的对照品溶液，0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

（2）黄芩苷、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱：精密称取黄芩苷、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱对照品适量，加入70%甲醇制得浓度分别为黄芩苷805 μg/mL、表小檗碱982 μg/mL、黄连碱1 066 μg/mL、巴马汀948 μg/mL、盐酸小檗碱944 μg/mL的对照品溶液，0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 线性关系考察 精密吸取“2.4.3”项下对照品溶液进行稀释，制成含甘草苷质量浓度929.1、464.55、232.275、116.137 5、58.068 75、29.034 375 μg/mL，甘草酸质量浓度906.204、453.102、226.551、113.275 5、56.637 75、28.318 875 μg/mL，黄芩苷质量浓度805、402.5、201.25、100.625、40.25、20.125 μg/mL，表小檗碱质量浓度982、245.5、122.75、61.375、30.687 5、15.343 75 μg/mL，黄连碱质量浓度1066、533、266.5、133.25、66.625、33.312 5 μg/mL，巴马汀质量浓度948、474、237、118.5、59.25、29.625 μg/mL，盐酸小檗碱质量浓度944、295、147.5、59、29.5、14.75 μg/mL的对照品溶液。按照“2.3.1”项下对应的色谱条件进样测定，以对照品质量浓度为横坐标（），峰面积为纵坐标（），绘制标准曲线，计算回归方程。结果分别为甘草苷＝17.755＋42.852，＝0.999 9，线性范围29.0～929.1 μg/mL；甘草酸＝5.3065－28.088，＝0.999 9，线性范围28.3～906.2 μg/mL；黄芩苷＝25 798＋733.21，＝0.999 6，线性范围16.1～1 610.0 μg/mL；表小檗碱＝33 494＋339.26，＝0.999 4，线性范围15.3～982.0 μg/mL；盐酸黄连碱＝34 575＋52.274，＝0.999 9，线性范围33.3～1 066.0 μg/mL；盐酸巴马汀＝53 084＋568.63，＝0.999 9，线性范围29.6～948.0 μg/mL；盐酸小檗碱＝28 223＋282.18，＝0.999 7，线性范围14.8～944.0 μg/mL；结果表明，甘草苷、甘草酸、黄芩苷、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱在各自的线性范围内线性关系良好。

2.4.5 精密度考察 取GXD基准样品（S1）供试品溶液，按“2.3.1”项下对应的色谱条件，连续进样6次，甘草苷、甘草酸、黄芩苷、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱峰面积的RSD值分别为0.58%、0.55%、0.06%、1.86%、0.05%、0.04%、0.06%，表明仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性考察 取GXD基准样品（S1）供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样，甘草苷、甘草酸、黄芩苷、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱峰面积的RSD值分别为0.74%、0.06%、0.42%、0.24%、0.39%、0.53%、0.45%，表明24 h内供试品溶液稳定性良好。

2.4.7 重复性考察 取GXD基准样品（S1）冻干粉，按照“2.3.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，甘草苷、甘草酸、黄芩苷、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱质量分数的RSD值分别为0.67%、0.02%、0.18%、0.13%、0.09%、0.17%、0.10%，表明该方法重复性良好。

2.4.8 加样回收率考察 精密称取9份已测定指标成分含量的GXD基准样品（S1）冻干粉样，按照加入对照品含量与样品含量分别为1.5∶1、1∶1、0.5∶1精密加入相应甘草苷、甘草酸、黄芩苷、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下相应色谱条件进样，计算加样回收率，结果甘草苷、甘草酸、黄芩苷、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的平均加样回收率分别为101.96%、100.38%、99.43%、99.17%、101.57%、102.26%、99.21%，RSD分别为1.35%、1.54%、1.80%、1.00%、0.65%、1.84%、1.94%，表明方法加样回收率良好。

2.5 样品含量测定及量值传递关系研究

将GXD 15批药材、饮片、基准样品的样品按照“2.4”项下色谱条件进样分析，测定各样品中指标性成分含量并计算其在药材-饮片-基准样品过程中的转移率，药材到饮片转移率＝饮片中指标性成分含量/对应批次药材中指标成分含量，饮片-基准样品转移率＝(基准样品中该指标成分含量×该处方基准样品质量)/(饮片中该指标成分含量×饮片投料量)[11-12]，结果见表4、5。可知，甘草苷、甘草酸、黄芩苷、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱从药材-饮片转移率均值为98.69%、98.13%、96.94%、94.59%、91.76%、88.08%、94.16%，转移率皆在均值的±30%内，未出现离散数据，符合相关规定[8]，表明了药材在炮制工艺稳定。

饮片到基准样品平均转移率分别为49.08%、42.24%、28.34%、26.72%、29.32%、33.62%、47.93%，15批基准样品中饮片-GXD的基准样品的转移率均在均值的±30%内，未出现离散数据，即GXD中有效成分在饮片及煎煮过程中转移率较一致，说明GXD的基准样品制备工艺较为稳定。

此外，GXD的基准样品的出膏率、水分、浸出物的结果均在均值的±30%内，未出现离散数据，说明上述指标在GXD的基准样品批次间较稳定，进而验证了GXD的基准样品制备工艺的稳定。

3 讨论

3.1 GXD特征图谱供试品溶液制备方法考察

本实验前期通过对提取方式、提取溶剂、提取时间、料液比等进行考察，最终确定样品制备方法，称取GXD基准样品冻干粉0.2 g，加入70%甲醇10 mL，超声提取30 min，放冷，称定质量后用70%甲醇补足减失的质量，滤过，取续滤液，即可。

表4 GXD药材、饮片、基准样品中指标成分含量

Table 4 Content of index components in GXD herbs, decoction pieces and benchmark samples

编号甘草苷/%甘草酸/%黄芩苷/%表小檗碱/%黄连碱/%巴马汀/%盐酸小檗碱/% 药材饮片基准样品药材饮片基准样品药材饮片基准样品药材饮片基准样品药材饮片基准样品药材饮片基准样品药材饮片基准样品 S12.332.270.693.643.520.6911.7211.451.921.721.640.071.451.340.061.251.051.055.865.635.63 S22.402.340.784.013.980.6813.7512.932.011.511.370.061.641.470.051.171.091.095.845.555.55 S31.661.670.602.672.710.5714.5713.282.010.860.790.041.831.790.061.471.271.276.246.146.40 S41.971.930.703.052.970.5815.8615.802.241.061.020.061.581.370.071.371.181.185.986.076.17 S51.931.900.603.583.590.5311.8411.121.511.151.140.061.381.240.071.291.131.136.555.825.82 S61.681.670.593.273.280.5413.0412.901.681.151.080.061.641.480.071.321.181.186.825.795.79 S70.990.900.313.903.720.3114.6714.882.262.342.110.101.591.410.081.311.211.105.565.445.64 S81.611.640.522.872.800.5111.2510.741.571.000.930.051.971.930.071.181.081.086.155.625.62 S91.681.580.593.273.280.3812.2512.352.010.800.780.041.581.380.071.331.191.196.196.046.05 S100.520.530.192.682.600.1814.9514.572.461.281.190.041.691.590.091.251.191.197.146.056.05 S110.670.660.213.583.660.1712.9212.892.021.151.060.051.611.460.091.351.131.136.045.665.66 S120.500.510.183.813.610.1411.5811.811.990.950.910.041.641.410.081.361.121.126.275.685.68 S130.610.610.232.062.080.1813.0812.311.601.081.090.051.651.390.091.461.191.196.315.985.98 S140.630.630.243.183.000.1812.3511.651.741.621.510.071.491.510.051.301.181.135.775.685.68 S150.500.510.173.813.610.1211.9211.121.420.970.930.041.941.930.071.461.281.186.116.026.02

表5 GXD药材、饮片、基准样品中指标成分转移率

Table 5 Transfer rate of index components in GXD herbs, decoction pieces and benchmark samples

批号甘草苷转移率/%甘草酸转移率/%黄芩苷转移率/%表小檗碱转移率/%黄连碱转移率/%巴马汀转移率/%盐酸小檗碱转移率/% 药材-饮片饮片-基准样品药材-饮片饮片-基准样品药材-饮片饮片-基准样品药材-饮片饮片-基准样品药材-饮片饮片-基准样品药材-饮片饮片-基准样品药材-饮片饮片-基准样品 S197.6143.5796.7443.2597.7031.9095.3525.4992.4127.3184.0033.0796.0851.55 S297.5347.8599.1341.5994.0429.6390.7325.2389.6318.6393.1639.5095.0346.26 S3100.6551.37101.4548.3791.1528.7591.8628.8497.8119.1986.3934.9398.4052.77 S497.9352.0997.4342.7399.6226.9796.2332.1186.7130.8286.1337.11101.5145.09 S598.6944.76100.1239.4393.9225.7599.1327.6289.8632.2187.6032.1588.8551.89 S699.4050.11100.3245.3098.9324.4293.9131.3590.2428.2689.3937.5684.9036.40 S790.9248.3895.2448.08101.4328.5390.1725.9088.6831.8692.3740.7397.8448.17 S8101.7045.0797.4144.8395.4727.9593.0029.9097.9720.5491.5336.4591.3843.09 S994.2952.83100.2933.86100.8230.6897.5025.6687.3428.6689.4727.2597.5848.63 S10101.1550.6996.9247.2197.4631.6892.9721.1594.0832.3795.2033.8784.7356.93 S1198.0444.96102.2136.7899.7729.8392.1727.4690.6835.2083.7030.3293.7145.40 S12101.5950.0594.7338.32101.9932.0695.7925.1385.9832.4382.3530.6390.5945.29 S1399.8253.56100.6341.3394.1124.47100.9326.9384.2435.2281.5136.0894.7749.05 S14100.7353.5794.5839.8194.3328.2393.2126.36101.3418.4490.7720.4098.4444.89 S15100.3647.3194.7332.6493.2924.2295.8825.8199.4820.5487.6729.0898.5350.98 均值98.6949.0898.1342.2496.9428.3494.5926.7291.7629.3288.0832.6294.1647.93 SD/%2.923.272.633.833.402.723.062.385.272.664.112.905.094.49 RSD/%2.966.902.689.073.519.593.238.905.749.074.678.905.419.37

3.2 基准样品特征峰归属

15批GXD基准样品的特征图谱共确定了22个共有峰，对色谱峰进行归属，并从色谱峰个数来看，甘草、黄芩、黄连对特征图谱贡献较大，干姜对于指纹图谱贡献较低，半夏、大枣未指认出特征峰。半夏主要成分为生物碱、有机酸、氨基酸，多次汤洗，成分损失大，水煎液中含量极少[13]，大枣为方中佐药，主要含有多糖、齐墩果酸，水煎液中含量极低[14]。半夏、大枣在本实验条件下特征峰不明显，后续将对其采取单独建立特征图谱或含量测定方法进行研究。

3.3 指标成分含量测定分析

GXD主治溃疡性疾病、具有抗炎的功效。通过古籍考证与参考文献选用与病症相关的药效成分，有研究表明，甘草中的甘草苷、甘草酸有抗菌、抗炎多种作用[15-20]，黄芩中黄芩苷具有较强的杀菌作用[21-26]，黄连主要活性成分是生物碱类化合物[27-29]，小檗碱具有明显抗炎作用[30]，且黄芩、黄连联用可解湿热疫毒[31]。上述成分稳定，在GXD基准样品中含量较高，且皆为《中国药典》2020年版药材项下规定的指标成分。GXD中6-姜辣素虽有抗炎活性，但因干姜为佐药，方中含量较低且对热不稳定，在煎煮过程中受到温度与时间的影响，造成含量变化，故不选用6-姜辣素为指标性成分[32]。综上，本研究共选取甘草苷、甘草酸、黄芩苷、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱7个指标成分建立含量测定方法，进行GXD药材-饮片-基准样品中量值传递的研究。

研究过程中发现，药材-饮片中有效成分转移率均值比饮片-基准样品成分转移率均值高，造成此情况的原因可能为药材-饮片的炮制过程是仅为自身药材的洗、切，而饮片-基准样品过程是需通过煎煮加热方式完成的，在此过程中有效成分溶出、分解受到一定的影响，或因中药在煎煮过程中成分易发生复杂化学反应，影响成分含量值，具体原因有待进一步验证。此外，在药材-饮片传递过程中，甘草苷及甘草酸的转移率较为一致，而饮片-基准样品过程中甘草苷的转移率比甘草酸的转移率略高，可能由于甘草苷在水中溶解性高于甘草酸，甘草酸受热易分解转化为甘草次酸，药典中选用甘草酸铵而非甘草酸为对照品也侧面印证了甘草酸溶解性不佳、相对不稳定。且在药材合煎过程中，甘草中甘草酸易发生氧化反应，或与黄连中的小檗碱发生酸碱中和反应生成新的化合物[33]，可能为不溶于水的双小檗碱单甘草酸盐沉淀[34]，导致甘草酸在饮片-基准样品过程中的转移率略低于甘草苷。在饮片-基准样品传递过程中还发现黄芩苷与黄连中生物碱的转移率明显降低，对此进行研究发现，黄连、黄芩水提取液皆为澄清透明，混合后明显有大量沉淀生成，在GXD在煎煮中自沉淀现象较为明显，究其原因可能为黄芩中主要成分黄芩苷的结构中存在羧基，是一种显酸性的苷类物质，易同黄连中的生物碱成分发生酸碱中和[35]，产生沉淀，导致煎液中生物碱中的溶出率降低[36]。此外，煎剂易在过滤时少许沉淀附着在绢布上或在冻干并收集冻干粉过程中可能产生些许损耗，导致一些成分含量降低，后续课题组将进一步研究。

中药复方成分复杂，基准样品的研究是中药复方制剂的关键。本研究建立了GXD基准样品的特征图谱及指标性成分含量测定方法，通过指标成分含量对GXD从药材-饮片-基准样品进行量值传递研究，结果表明，7个指标成分对应批次间的转移率皆在规定范围（均值70%～130%）内，说明GXD的药材炮制工艺以及基准样品制备工艺稳定可行，成分具有良好稳定地传递性，为后续经典名方GXD制剂开发奠定基础，为基准样品质量控制研究提供了参考。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Research on quantitative transmitting of classical prescription Gancao Xiexin Decoction substance benchmarks

WANG Meng-yuan, HUO Ran, YU Meng-han, XU Wei, QIU Zhi-dong, QIU Ye

School of Pharmaceutical Sciences Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China

To establish the HPLC profiles and methods for detecting the index components in benchmark sample of the classical recipe Gancao Xiexin Decoction (GXD, 甘草泻心汤) to explicit its law of quantity value transfer.Fifteen batches of GXD substance benchmarks were prepared to establish characterization profiles. The similarity was evaluated by similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM, to attribute the characteristic peaks. The the index components of liquiritin, glycyrrhetinic acid, baicalin, berberine hydrochloride, epiberberine, coptisine and palmatine were determined to calculate the transfer rates of the index components and analyze quantitative transfer laws of index components between decoction pieces and samples.The similarities of 15 batches of GXD benchmark sample fingerprint profiles were all higher than 0.90. Totally, 22 common peaks were identified, thereinto, five for Gancao (et, GRR), five for Huangqin (, SR), three for GRR and SR, six for Huanglian (, CR), two for SR and CR, and one for Ganjiang (). The average transfer rates of herbs to decoction pieces were 98.69%, 98.13%, 96.94%, 94.59%, 91.76%, 88.08%, 94.16% respectively; Average transfer rates of decoction pieces to benchmark sample were 49.08%, 42.24%, 28.34%, 26.72%, 29.32%, 33.62%, 47.93% respectively.The research on quantitative transmitting of herbs-decoction pieces-benchmark sample of GXD by combination chromatographic fingerprint and multi-indicator determination method, which can provide references for the the formulation development of classic GXD.

classical prescriptions; Gancao Xiexin Decoction; benchmark samples; characteristic chromatogram; liquiritin; glycyrrhetinic acid; baicalin; berberine hydrochloride; epiberberine; coptisine; palmatine; quantity value transferring

R283.6

A

0253 - 2670(2023)16 - 5214 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.16.010

2023-03-14

吉林省发改委项目“经典名方甘草泻心汤物质基准的建立”（2021C035-4）

王孟缘（1999—），女，硕士研究生，主要从事中药基础研究与新药开发。E-mail: 2836133491@qq.com

邱 野（1989—），男，博士研究生，副教授，主要从事中药炮制的方法与机制及其生物活性物质发现与评价研究。E-mail: ccyeqiu@163.com

[责任编辑 郑礼胜]