固体面膜中花青素皮肤渗透性评价

李和伟 魏国志 许飞飞

为探索评估固体面膜中花青素皮肤渗透适合的皮肤模型。本文以面膜中3 个花青素：飞燕草素-3-O- 半乳糖苷（Delphinidn-3-O-galactoside， DEGA）、飞燕草素3- O- 葡萄糖苷（Delphinidn-3-O-glucoside， DEGL） 和矢车菊素-3- O- 葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside， CYGL） 为指标成分，以巴马小型猪离休皮肤为皮肤模型材料，应用Franz 扩散池，以HPLC 法分别测定面膜中3 个花青素在不同时间点的皮肤表面残留量、皮肤中滞留量和经皮累积透过量。固体面膜贴敷20 min 后即拿掉面膜，12h 內花青素在皮肤表面残留量和皮肤内滞留量仍较多，这能为花青素发挥抗紫外线和美白双重功效提供化学基础。贴敷12h 后，在透皮接受液中可少量检测到3个花青素成分，这进一步确保了花青素成分可以达到皮肤较深的基底层。所以可得出，以巴马小型猪离体皮肤作为透皮材料，同时检测皮肤表面残留量、皮肤内滞留量和皮下经皮透过量的评估方法是适合于评估花青素面膜双重功效的研究模型。

关键词：花青素；固体面膜；皮肤表面残留量；皮肤内滞留量；经皮渗透

花青素是一类广泛存在于植物中的天然水溶性色素，是花色苷水解而得有颜色的苷元，属于黄酮类化合物[1]。

花青素具有多种生物活性，如抗氧化、延缓衰老、调节脂类和糖类代谢等[1]。此外，研究发现花青素中一些成分具有较强的皮肤美白作用。文献报道[2]，矢车菊素-3-O- 葡萄糖苷在人体中的主要代谢产物（原儿茶酸） 通过抑制酪氨酸酶，可以有效减少皮肤黑色素的生成，从而实现美白皮肤的效果。矢车菊素-3-O- 葡萄糖苷、飞燕草素及其糖苷、牵牛花色素和二甲花翠素及其糖苷均能有效抵御紫外线辐射，防止皮肤细胞因紫外线辐射而发生氧化应激反应和凋亡[3，4]。花青素的防紫外线和美白皮肤活性逐渐受到化妆品领域的青睐，一些面膜产品也开始加入植物花青素。

小型猪皮肤的各种生理属性（主要包括皮肤厚度、脂质含量、毛囊密度和酶活性） 和通透性被公认与人类皮肤最接近，欧盟委员会和世界卫生组织（WHO） 等多个国际组织一致认定该模型为最理想的替代人类皮肤进行经皮给药研究的离体皮肤模型[5]。本研究采用巴马小型猪皮肤模型评价面膜中花青素的经皮渗透性。

本研究采用分层冷冻干燥技术制备固体花青素面膜，所使用植物花青素为欧洲越桔花青素提取物。在这个研究中，我们以3 个含量较高的代表性花青素DEGA、DEGL和CYGL 为指标成分，采用巴马小型猪皮肤模型，建立一种评估面膜中花青素经皮渗透的新方法，即同时测定不同时间点的单位皮肤表面残留量、皮肤中滞留量和皮下透过量。具体研究过程如下：建立同时测定DEGA、DEGL和CYGL 分析方法并进行方法学验证；以DEGA、DEGL 和CYGL 为指标，分别评估面膜贴敷20min 和12h 后面膜中3 个花青素成分在不同时间点单位皮肤表面残留量，以及皮肤内部滞留量和经皮累积透过量。

01 仪器与材料

1.1 仪器

BSA2202（ 精度0.01g） 型，CPA225D 型（精度0.01mg）天平（赛多利斯公司）、LC-16 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）、SPD-16 型紫外检测器（日本岛津公司）。TT-B（D） 型Franz 透皮试验仪（天津市正通科技有限公司）；800D-1 型离心机（常州天瑞仪器有限公司）；F6/10 型电动均浆机（上海净信实业发展有限公司）。

1.2 材料

花青素面膜（批号WB-HQS-220804），常州伟博海泰化妆品有限公司研制；矢车菊素-3- O- 葡萄糖苷对照品（纯度：99.5%，坛墨质检科技股份有限公司）; 飞燕草素-3-O- 半乳糖苷（纯度≥ 99%，上海诗丹德标准技术服务有限公司）; 飞燕草素3- O- 葡萄糖苷（纯度≥ 99%，美国ChromaDex 公司）；Luna C18 色谱柱（Phenomenex公司）；FiveEasy Plus 型 pH 计（梅特勒- 托利多仪器有限公司）；BIO-DL 型移液枪（赛多利斯公司）；滤膜（0.22μm，天津津腾公司）；色谱纯乙腈（Fisher 公司）；实验用水为超纯水（杭州娃哈哈集团有限公司）；95% 酒精，生理盐水，磷酸二氢钾，磷酸为分析纯（北京化工集团股份有限公司）。

1.3 动物

巴马小型猪[ 合格证号：SCXK（苏）2022-0013，泰州泰和生物科技有限公司，雄性，日龄30，体重2.5 ～ 3.5 kg]。

02 方法与结果

2.1 HPLC 测定3 个花青素的含量

2.1.1 色谱条件

色谱柱为C18（4.6 mm150 mm，3.0 μm）；流动相A为87% 乙腈：3% 水：10% 甲酸， 流动相B 为50% 乙腈：40% 水：10% 甲酸，梯度洗脱程序：0～20min， 2%～14% A;20～25min， 14% A; 25～35min， 14%～30%A；流速 0.8mL/min；柱温 30℃，检测波长 520nm；进样量 20μL。

2.1.2 对照品溶液制备

精密称取DEGA、DEGL 和CYGL 对照品各约10 mg，加入2% 甲酸- 甲醇溶液溶解并定容于10mL 棕色量瓶中，摇匀，即得浓度约为1.0mg/mL 的混合对照品储备溶液，备用。

2.1.3 线性关系考察

用移液枪分别量取不同体积的对照品溶液，再加入2% 甲酸- 甲醇溶液进行稀释，摇匀，配制成质量浓度分别为100、50、5、2.5、1.0、0.10μg/mL 的系列对照品溶液。分别吸取上述各浓度对照品溶液各20 μL 依次注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以对照品浓度为横坐标（X ），峰面积为纵坐标（Y ），绘制标准曲线，得DEGA 回归方程为Y ＝ 5.62E +04X -2.02E +04，r ＝ 0.9997; DEGL 回归方程为Y ＝ 5.14E +04X -2.37E +04，r ＝ 0.9996; CYGL 回归方程为Y ＝ 4.4E +04X -1.35E +04，r ＝ 0.9998。结果表明，DEGA、DEGL 和CYGL 的线性浓度分别为0.10 ～ 99.7μg/mL、0.11 ～ 106.3 μg/mL 和0.10 ～ 102.7μg/mL。

2.1.4 精密度试验

取混合对照品（约5μg/mL） 溶液 20 μL，分别于同1d 之内连续进样测定6 次，并在6d 之内连续进样测定，记录峰面积。结果显示3 个对照品溶液日内精密度RSD分别为1.21%、1.02%、1.71%，日间精密度RSD 分别为2.66%、1.95%、2.24%。

2.1.5 稳定性试验

精密量3 份取供试品溶液（猪皮表面残留样品，猪皮内滞留样品和接收液样品） 各20μL，避光放置在室温条件下，分别于0、1h、2h、4h、8h、24h 测定峰面积，結果显示峰面积RSD 分别为1.90%、2.63% 和1.68%，表明供试品溶液在室温条件下24h 内稳定性良好。

2.1.6 回收率试验

取空白巴马小型猪新鲜猪皮3.14cm2，剥离角质层，量取混合对照品溶液（5μg/mL） 涂抹于猪皮表面，加入2% 甲酸- 甲醇超声，提取2 次，每次10.0mL，合并提取液，5000 转离心10min， 上清液0.22μm 滤膜过滤；将剪碎的猪皮肤中加入混合对照品溶液（5μg/mL），再加入2% 甲酸- 甲醇超声，提取2 次，每次10.0mL 水，合并提取液，5000 转离心10min， 上清液0.22μm 滤膜过滤；在已知浓度（2.5μg/mL） 的pH3.0 磷酸盐缓冲液中按1：1 比例分别加入对照品溶液。每个样品平行制备3 份供试品，按“2.1.1” 项下色谱条件测定，计算回收率。3 个样品中3 个对照品回收率范围为分别为98.7% ～ 101.9%、98.6% ～ 101.3%、99.9% ～ 101.6%，RSD 值均小于3.0%。

2.1.7 专属性试验

取供试品溶液，混合对照品溶液、阴性样品（空白接收液和猪皮提取液），按“2.1.1” 项下色谱条件检测，记录色谱图（ 图1）。对照品峰形良好，供试品与对照品在相应位置上存在相同峰，且阴性样品溶液对测定结果不产生干扰。

2.2 离体猪皮透皮试验

2.2.1 离体猪皮制备

巴马小型猪处死后立即剪取腹部皮肤，剥离皮下脂肪和结缔组织，用95%酒精棉球反复擦拭皮肤表面，再用生理盐水冲冼干净，滤纸吸干水分，备用。

2.2.2 试验步骤

参考文献方法[6，7]，应用Franz 透皮试验仪进行透皮试验，水浴温度为370.5° C，搅拌速度为100r/min，扩散池暴露的皮肤面积为3.14cm2， 接收池体积为12mL，接收溶液为pH3.0 磷酸盐缓冲液。将面膜剪成3.14cm2 小块，贴敷于皮肤，固定在接收池上，仪器避免直接暴露在阳光下，开始试验。皮肤表面残留样品：分别于面膜贴敷后0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h 后 （ 贴敷面膜12h 和贴敷20min 后去除面膜试验），取下面膜，用棉球擦拭干净皮肤表面残留物，再用3 只棉球分别蘸2% 甲酸- 甲醇溶液擦拭皮肤表面3 次，然后将这些棉球放在2% 甲酸- 甲醇溶液中超声提取，冷却置室温，定容置10mL。为了减少实验误差对结果的影响，每个时间点平行6 份。皮肤内滞留样品：分别取经0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h 透皮吸收后的猪皮肤，用滤纸吸干吸收液，去除皮肤表面残留的面膜（方法同），将皮肤剪碎，在匀浆机内加入10mL 2% 甲酸- 甲醇溶液进行匀浆处理，离心，取上清2mL，每个时间点平行3 份。皮下接收液样品：试验开始后，分别于0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h 取接收液0.5mL，取样后向接收池内补充同体积接收液。所有样品溶液经0.22μm微孔滤膜过滤，待测。

2.3 数据分析

单位面积皮肤上面膜中花青素皮肤表面残留量和皮肤内滞留量，按如下公式（1） 计算：

2.4 猪皮肤模型中3 个花青素残留量、滞留量和渗透量（面膜贴敷12h）

图1 显示了花青素面膜在猪皮肤模型中贴敷12h 时，DEGA、DEGL和CYGL 在猪皮肤表面残留量、猪皮肤内滞留量和接收液中经皮透过量测定结果。结果显示，3 个花青素成分从面膜中释药到皮肤表面速度较快，4h 时3 个成分在单位皮肤表面残留量Qr1 基本达平（图2A）； 3 个花青素成分从面膜中透过角质层进入皮肤内速度较慢，单位面积皮肤内滞留Qr1 需要8h 才能达峰（图2B）；相比较而言，3 个花青素成分经皮透过进入接受液的速度更慢，12h 的Qt1 也未达峰。研究结果表明，面膜中3 个花青素成分在4 h 基本从面膜中释放完全；8h 皮肤中3 个成分驻留量远高于经皮渗透量，分别达到5.0、4.6倍和4.8 倍。

2.5 猪皮肤模型中3 个花青素残留量、滞留量和渗透量（面膜贴敷20 min 去除）

面膜实际使用的贴敷时间一般为20min 左右， 因此我们进一步研究了面膜贴敷20min，然后去除面膜，面膜中花青素成分在猪皮肤表面残留量、猪皮肤内滞留量和接收液中透过量测定结果。如图3A 所示，去除面膜之后约2h 后，猪皮肤表面的3 个花青素成分Qr1 基本停止下降，这表明3 个花青素成分在面膜去除之后2h 基本不再能透过皮肤表面角质层了，并且2 ～ 12h 内3 个花青素成分在皮肤表面残留量基本保持不变。如图3B 所示，在去除面膜的前2h，皮肤中滞留的花青素逐渐上升；相反，在2～12h，皮肤中滞留的花青素缓慢下降，表明花青素成分逐渐进入皮下接收液，12h 花青素成分在皮肤中仍有较高的滞留量。如图3C 所示，3 个花青素成分经皮透过Qt1随时间逐渐增加， 但12h 三个花青素的累积透过量也分别仅为皮肤中滞留量的20%、23% 和27%。

03 讨论

在这个研究中，我们首先建立花青素面膜中3 个花青素DEGA、DEGL 和CYGL 同时测定的分析方法，并进行了方法学验证。然后，我们采用巴马小型猪皮肤为经皮透过模型，测定花青素面膜在分别贴敷12h 和20min 时，3个花青素成分于不同时间点在皮肤表面残留量、皮肤中滞留量和皮下的透过量时间曲线，为指导花青素面膜的开发提供评估方法。

3.1 评估方法中花青素指标成分选择

文献报道的欧洲越桔中含有的花青素成分有15个[8，9]，其中DEGA、DEGL 和CYGL 不仅是欧洲越桔中含量最高的3 个成分[8]，而且文献报道这3 个成分具有皮肤美白和抗紫外线的活性[2-4]。因此，我们选择这3 个花青素单体作为指标成分来评估我们研制的花青素面膜。

3.2 花青素的稳定性

花青素类成分在pH 大于3 的溶液中稳定性较差，并且最大吸收波长也会发生变化[10]。考虑到pH 值对花青素的稳定性影响较大，我们在透皮试验时接收液的pH 设置为3.0 的磷酸盐缓冲液。在避光条件下，花色素在溶液中24h 内是可以稳定，因此我们在实验中尽量将透皮接受仪置于避免日光直晒的环境下。实验研究中也发现，猪皮表面残留的细菌可能会导致花青素成分降解，因此，我们在处理猪皮时采用95% 酒精棉球反复擦拭，再用生理盐水反复冲洗的处理方式，这样可以避免花青素接触猪皮时被细菌降解。

3.3 面膜贴敷时间对花青素在皮肤表面残留量、皮肤中滞留量和皮下透过量的影响

面膜贴敷12h 是为了获得面膜中花青素成分在皮肤表面、皮肤中和皮下透过的更完整数据。研究面膜贴敷20min 是为了观测实际使用时间下花青素成分在皮肤3个部位的释放或透过情况。面膜贴敷20min 时，DEGA、DEGL 和CYGL 能从面膜中释放一定数量（图2A）。因此，面膜在实际使用中贴敷20min 是可以在皮肤表面获得一定水平的花青素成分的。贴敷20min 后即拿掉面膜，皮肤表面花青素只能持续约2h 渗透进入皮扶（图3A），这可能是由于2h 之后面膜中残留在皮肤上的水分和其他基质成分已经挥干，因而不利于花青素成分继续渗透进入皮肤。12h 时皮肤表面仍然有较大量花青素残留，这说明花青素面膜对于皮肤抗氧化和防紫外线是可以起到保护作用的。

相比贴敷12h， 贴敷20min 后即拿掉面膜，皮肤内花青素的滞留量下降约为50%（以8h 为点计算）。尽管花青素皮肤内滞留量下降，但皮肤内仍存有大量花青素，这为面膜中花青素成分到达基底层，作用于黑色素细胞，从而真正起到美白皮肤作用提供了化学基础。通过测试皮下接收液中花青素的透过量，也间接确认花青素成分应该可以透过皮肤进入体循环，这为花青素成分能透过皮肤角质层到达基底层发挥美白作用提供进一步数据支持。

3.4 本研究提供了一种评估花青素面膜的新模型

为了同时实现防紫外线和美白效果，需要在皮肤表面保留一部分花青素，同时让另一部分花青素停留在皮肤内部，并持续足够长的时间。目前，多数文献研究只是测定药物在皮下接收液中透过量[11-13]，较少研究同时测定皮肤中滞留量和皮下透过量[14]。本研究以巴马小型猪皮肤为经皮透过模型，同时测定皮肤表面残留量、皮肤中滞留量和皮下透过量，拟建立一種新的评估花青素面膜双功效的皮肤评估模型。

综上所述，本研究建立了一种全新的可用于评估花青素面膜抗紫外线和美白双功效的皮肤评估模型。