德昂族酸茶中的化学成分研究

梁名志，吕海鹏，杨天铭

（1. 云南省农业科学院茶叶研究所，云南 昆明 650205；2. 中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；3. 云南大学，云南 昆明 650091）

德昂族酸茶是德昂族长期饮用和食用的一种极具特色的传统微生物发酵茶产品，制作工艺及品质风味独特，被列为第4 批云南省省级非物质文化遗产代表性项目名录，“德昂族酸茶制作技艺”也入选了第五批国家级非物质文化遗产代表性项目名录。有研究发现，德昂族酸茶水提物可改善高脂饮食小鼠血脂水平，减少肝组织的脂肪变性，具有一定的保肝作用[1]；还具有预防大鼠非酒精性脂肪肝的作用[2]；此外，德昂族酸茶可维持高脂饮食小鼠肠道微生态的平衡，降低厚壁菌门与拟杆菌门的比值，对减肥具有积极的意义[3]。另有一些相关研究指出，酸茶还具有多种保健功效，如降压安神、改善睡眠、抗氧化、抗焦虑、抗肿瘤、延缓衰老及调节免疫等[4]；酸茶富含益生菌，具有一定的开发价值[5]；应该加大对德昂族酸茶功效的研究力度[6]。因此，目前开展德昂族酸茶中的化学成分的研究工作具有重要的意义，有助于揭示德昂族酸茶风味品质和保健功效的重要化学物质基础，为德昂族酸茶的品质评价、新产品开发及加工工艺提升等提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

酸茶样品，来自于云南德凤茶业有限公司2018年生产的产品。

1.2 试验方法

1.2.1 德昂族酸茶中主要化学成分测定

水分含量测定参照国标GB 5009.3—2016 操作方法；水浸出物含量测定参照国标GB/T 8305—2013操作方法；茶多酚、儿茶素类物质含量测定参照国标GB/T 8305—2018 操作方法；咖啡碱含量测定参照国标GB/T 8312—2013 测定方法；氨基酸组成测定采用氨基酸自动分析仪；有机酸和维生素成分测定采用基质辅助激光解析-飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS） 方法。

1.2.2 德昂族酸茶中非挥发性成分分析

酸茶样品代谢物鉴定采用超高效液相色谱（SHIMADZU Nexera X2） 和串联质谱（Applied Biosystems 4500 QTRAP） （UPLC-MS/MS） 法，委托迈维（武汉） 生物技术有限公司开展分析。

样品制备：利用研磨仪（MM 400，Retsch） 研磨（30 Hz，1.5 min） 至粉末状；称取100 mg 的粉末，溶解于70%甲醇提取液1.2 mL 中；每30 min 涡旋1 次，每次持续30 s，共涡旋6 次，样本置于4 ℃冰箱中过夜；以转速12 000 r/min 离心10 min 后，吸取上清，用微孔滤膜（0.22 μm pore size） 过滤样品，并保存于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS 分析。

液相条件：①色谱柱：Agilent SB-C181.8 μm，2.1 mm×100 mm；②流动相：A 相为超纯水（加入0.1%的甲酸），B 相为乙腈（加入0.1%的甲酸）；③洗脱梯度：0 min B 相比例为5%，0 min 内B 相比例线性增加到95%，并维持在1 min，10.00～11.00 min，B 相比例降为5%，并以5%平衡至14 min，流速0.35 mL/min，柱温40 ℃，进样量4 uL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），涡轮喷雾；源温度550 ℃；离子喷雾电压（IS） 5 500 V（正离子模式） /-4 500 V（负离子模式）；离子源气体Ⅰ（GSⅠ），气体Ⅱ（GSⅡ） 和帘气（CUR） 分别设置为50，60，25 psi，碰撞诱导电离（CAD） 参数设置为高。在三重四极杆（QQQ） 扫描和线性离子阱（LIT）模式下分别用10 和100 μmol/L 聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。QQQ 扫描使用多反应检测（MRM） 模式，并将碰撞气体（氮气） 设置为中等。

1.2.3 德昂族酸茶中挥发性成分分析

香气成分分析采用SBSE-GC-MS 方法[7]。

SBSE 香气富集：准确称取600 mg 茶粉与500 mg氯化钠加入20 mL 顶空瓶中，加入10 mL 沸水平衡1 min 后，加入PDMS 搅拌子，在磁力搅拌器上以转速1 200 r/min 搅拌萃取30 min 后取出搅拌子，并用纯净水洗净搅拌子表面残留茶粉，无纺布擦干后暂存放于1.5 mL 小瓶中待测。

GC-MS 分析：色谱参数为初始温度50 ℃，保持2 min，然后以4 ℃/min 的速度升温至170 ℃，保持5 min 后，以10 ℃/min 升温至265 ℃，保持5 min。溶剂排空模式，以高纯度氦（＞99.9%） 为载体，流速1.6 mL/min。质谱参数如下：离子源为EI，温度220 ℃，电子能量70 eV。质量扫描范围30～600 amu。定性分析：通过NIST 2014 数据库对GC-MS 检测的化合物定性，依据正构烷烃测得各化合物的保留指数试验值，与数据库中理论值对比，要求两者差值在20 以内。定量分析以相对含量表示。

2 结果与分析

2.1 德昂族酸茶样品中主要化学成分分析

茶叶中水浸出物是指在规定条件下，用沸水浸出茶叶中的水可溶性物质的统称，是茶汤的主要呈味物质，包括可溶性糖、茶多酚、游离氨基酸、咖啡碱等物质，其含量水平对茶叶品质有重要影响。

酸茶中主要化学成分的含量见表1。

表1 酸茶中主要化学成分的含量

由表1 可知，酸茶样品中水浸出物含量占干质量的49.60%，表明德昂族酸茶中内含物质比较丰富。此外，另有研究曾报道德昂酸茶中水浸出物含量高达52.70%[8]。

茶多酚是茶叶中的重要品质成分和活性物质，在茶汤中一般呈现苦涩味，其中儿茶素类是茶多酚的主体物质[9]。研究发现，酸茶中茶多酚的含量占干质量的27%，而儿茶素总量（5.87%） 仅占茶多酚总量的21.74%，占比比较低。这主要与酸茶的微生物发酵过程中多酚类成分的氧化聚合和生物降解有关[10]。德昂族酸茶中表没食子儿茶素（EGC）、儿茶素（D、L-C）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG） 含量分别为2.25%，0.86%，0.18%，2.33%，0.25%，其中非酯型儿茶素含量较高，而酯型儿茶素含量较低，含量规律与以往文献[8]报道的研究结果接近。

咖啡碱是茶叶中的主要嘌呤碱，是构成茶汤滋味的重要物质，也是茶叶理化审评的评价标准之一。德昂族酸茶样品中咖啡碱含量为3.6%，与常规茶产品差异不大。可溶性糖是茶汤中重要的甜味成分，对茶汤滋味品质有重要影响。德昂族酸茶样品中可溶性糖含量为3.70%，与常规茶产品的4%的含量水平比较接近[11]。有研究表明，酸茶发酵过程中，湿热作用和微生物作用会导致茶叶理化成分发生较大变化。随着酸茶发酵过程的进行，水溶性总糖的含量呈现先显著降低后显著上升的趋势，发酵末期含量达到2.97%[12]。

酸茶中氨基酸成分的含量见表2。

表2 酸茶中氨基酸成分的含量/%

氨基酸是茶叶中重要的品质成分，是构成茶汤鲜爽味的重要物质基础。由表2 可知，酸茶样品中的氨基酸总量为1.344%，其组分上以茶氨酸（1.022%）和谷氨酸（0.097%） 为主。有研究表明，酸茶发酵过程中游离氨基酸的含量显著升高[12]。

酸茶有机酸和维生素等成分含量见表3。

表3 酸茶有机酸和维生素等成分含量/%

由表3 可知，德昂族酸茶中乳酸和酚酸的含量较高，分别为0.85%和0.41%；维生素成分中以维B6和维B2的含量较高，分别为0.065 0%和0.011 2%。

以往有研究表明，不同级别德昂族酸茶中理化成分差异明显[13]。有研究表明，酸茶发酵属于厌氧发酵；由于微生物和茶叶水分的湿热协同作用，发生了茶多酚的氧化、缩合，蛋白质和氨基酸的分解、降解，碳水化合物的转化积累，以及各产物之间的聚合、缩合等一系列反应，使其茶汤酸涩，具有“酸”而略带清凉的香气特征。鉴于德昂族酸茶中化学成分的含量水平及其微生物发酵过程中的变化规律情况尚未系统揭示，未来仍需要扩大样本量进行系统分析。

2.2 德昂族酸茶中的非挥发性成分分析

采用基于UPLC-MS/MS 的代谢组学方法，从德昂族酸茶样品中共检测到1 130 个代谢物。

酸茶中代谢物数量统计见表4。

表4 酸茶中代谢物数量统计

由表4 可知，包括252 种黄酮类物质、203 种酚酸类、158 种脂质、106 种其他类物质、94 种氨基酸及其衍生物、94 种有机酸、71 种核苷酸及其衍生物、70 种生物碱、33 种木脂素和香豆素类、26 种鞣质、24 种萜类及8 种醌类。黄酮类、酚酸类、脂质以及氨基酸及其衍生物的代谢物数量和相对含量较高，相对含量分别占代谢物总量的14.39%，15.70%，25.50%，14.02%。

黄酮类化合物在茶叶中多以黄酮醇及其糖苷类的形式存在，是茶叶中重要的品质化学成分，也是重要的生物活性成分[14]。酚酸类成分也被证实具有抗氧化、抗诱变、抗癌、抗皱等多种功效，在治疗糖尿病、伤口愈合中发挥重要作用[15]。该研究发现，酸茶中存在高含量的黄酮类和酚酸类物质，可能是其保健功效的重要化学物质基础之一。酸茶样品中检测到的脂质成分以α -亚麻酸、γ -亚麻酸、11 -十八碳烯酸为主，都属于不饱和脂肪酸。研究表明，α-亚麻酸具有抗动脉粥样硬化、降血脂、保护心血管等功能[16]。 此外，检测到的代谢物中相对含量较高的还有6 -甲基巯嘌呤、3 -甲基黄嘌呤等成分。

2.3 德昂族酸茶挥发性成分分析

采用SBSE-GC-MS 方法，从德昂族酸茶样品中共鉴定出119 种挥发性成分。

酸茶中的挥发性成分见表5。

表5 酸茶中的挥发性成分

挥发性成分中，相对含量较高的化合物有植醇、对乙烯基苯酚、反式芳樟醇氧化物、棕榈酸异丙酯、反式- β -紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯、邻苯二甲酸二异丁酯、水杨酸甲酯、芳樟醇、香叶醇，等等，这些成分构成了德昂族酸茶挥发性成分的主体。

根据化合物的化学结构特点对上述119 种挥发

性成分进行分类，发现酸茶样品的香气成分中，有醛类物质9 种（总计1.76%）、醇类物质17 种（总计28.59%）、酯类物质17 种（总计21.31%）、酚类物质6 种（总计16.73%）、杂环类物质10 种（总计11.69%）、内酯类物质5 种（总计7.40%）、酮类物质16 种（总计6.65%）、碳氢化合物29 种（总计4.68%）、酸类物质7 种（总计1.36%）、醚类物质3 种（总计0.46%）。可见，德昂族酸茶挥发性成分中含有丰富的醇类物质、酯类物质和酚类物质等。酸茶中的关键致香成分后续尚需要通过GC-O 嗅闻试验和OAV 计算等进行分析。

德昂族酸茶中检测出的一些化合物，如4,6 -二（1,1 -二甲基乙基） - 2 -甲基苯酚和1,7,7 -三甲基双环[2.2.1]庚- 2 -烯等，可能是酸茶中能区别于绿茶、红茶等其他茶类的特殊物质[17]。后发酵中生成的甲氧基苯类化合物是发酵茶中重要的“陈香”成分，酸茶也存在多种甲氧基苯类化合物，如1,2,3 -三甲氧基苯和4 -乙基- 1,2 -二甲氧基苯等，可能对其香气品质有重要影响。

3 结论

研究初步查明了德昂族酸茶的水浸出物、茶多酚、儿茶素、游离氨基酸、咖啡碱、可溶性糖等主要成分的含量水平，并从德昂族酸茶中初步鉴定出了119 种挥发性成分和1 130 种非挥发性物质。研究结果表明，德昂族酸茶的内含物质丰富，展现出重要的开发价值。后续应加强德昂族酸茶风味品质、化学成分和保健功效的评价工作，以期为德昂族酸茶的加工工艺的提升及新产品开发利用等提供依据。