圈养黄颊长臂猿粪便皮质醇代谢分析

杨 波 ，屈元元 ，桓宗锦，赵 波，张松兰，董 礼，李登翯，朗舜筠，罗 波，李德生，钟 义，黄 炎

（1.中国大熊猫保护研究中心，大熊猫国家公园珍稀动物保护生物学国家林业和草原局重点实验室，邛崃山、岷山濒危野生动植物保护生物学国家长期科研基地，成都，610081；2.成都动物园（成都市野生动物研究所），成都，610081；3.中国野生动物保护协会，北京，100010）

黄颊长臂猿（Nomascus gabriellae）被IUCN 列为濒危（EN）物种，分布于越南南部、老挝南部、柬埔寨东部的热带、亚热带常绿阔叶林区域［1-2］。我国曾引入人工饲养，截至2016 年底圈养种群数量为89 只［3］。圈养野生动物由于受到生存空间限制、人为干扰（展览、施工、科研）和单一饲养模式等因素的长期影响，正常行为的表达受到干扰而易产生刻板行为，进而导致繁殖率和动物福利降低［4-5］。皮质醇（cortisol，CORT）属于一种糖皮质激素，参与糖类、脂肪和蛋白质的代谢，也常用来专指“应激激素”。皮质醇逐渐成为衡量机体产生应激效应的指标，被广泛应用于野生动物生存压力分析与环境丰容评估［6-7］。目前非人灵长类动物皮质醇研究主要集中在恒河猴（Macaca mulatta）［8］、黑猩猩（Pan troglodytes）［9］、滇金丝猴（Rhinopithecus bieti）［10］、黄山短尾猴（Macaca thibetana）［11］和川金丝猴（Rhinopithecus roxellana）［7，12］等，黄颊长臂猿皮质醇代谢的相关研究未见报道。本研究通过追踪测定1 对圈养黄颊长臂猿的粪便皮质醇水平，分析皮质醇代谢与游客干扰、季节和动物发情等因素的关系，以期为黄颊长臂猿圈养种群饲养与繁育管理提供一定的参考。

1 研究对象与饲养环境

试验对象来源于成都动物园（1 雄1 雌），雄性呼名为“Pete”，雌性呼名为“Vivi”，基本信息见表1。每日08：00和15：00投食，食物主要为香蕉、苹果、梨和葡萄等水果以及长臂猿窝窝头、鸡蛋和小叶女贞（Ligustrum quihoui）叶（自由采食）等。试验期间，研究对象采食良好，身体健康。

表1 试验对象基本信息Tab.1 Basic information of experimental subjects

饲养环境由室内展厅和室外展厅组成。内展厅呈五边形，两面玻璃、两面水泥，另有一面为铁门，面积约40 m2，高约5 m。厅内设有供暖系统（冬季控温10～15 ℃），还有平台、绳梯和栖架等；室外展厅为不规则多边形，两面为玻璃，顶部为铁丝网，其余面为水泥，总面积约60 m2，高约6 m。厅内有绳梯、平台、栖架和轮胎等，还种植有小叶女贞、南天竹（Nandina domestica）和花叶艳山姜（Alpinia zerumbet‘Variegata’）等。

2 研究方法

2.1 样品采集与处理

2016 年4 月—2017 年4 月，每日08：00—11：30收集粪便样品，每1～3 d 采样1 次。共收集雌性粪样199 份，雄性粪样166 份。利用一次性PE 手套采样后装入自封袋，并记录供者名称与采样时间，1 h 内置于-20 ℃冻存。采用冻干研筛法预处理粪样（冻干机型号为Telstar LyoQuest-55），粪便粉末置于-75 ℃冻存。

2.2 激素提取与测定

激素提取与测定参考唐丹等［13］的方法，利用90%乙醇溶液萃取粪便激素，并采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定粪便提取液中皮质醇和雌激素（estrone-3-glucuronide，E1G）水平。

2.3 数据处理与统计

ELISA精确度：批内变异系数（Cv）≤5%，批间变异系数（Cv）≤10%。利用SPSS 22.0 进行数据处理与分析，采用one sample Kolmogorov-Smirnov test进行正态分布检验。均不符合正态分布，故采用非参数检验（nonparametric tests Mann-WhitneyU）进行差异性分析。皮质醇与雌激素的相关性利用Pearson法分析（双尾检验）。统计结果以平均值±标准差（mean±SD）表示，显著性水平设α=0.05，极显著性水平设α=0.01。

3 结果

3.1 假期对皮质醇的影响

统计发现（图1），雌性Vivi在节假日（包括国家法定节假日和公休日）粪便皮质醇为（146.9±118.1）ng/g（n=64），非节假日皮质醇为（127.0±123.3）ng/g（n=135），两者无显著差异性（Z=-1.872，p=0.061）；雄性Pete 在节假日皮质醇为（89.9±75.7）ng/g（n=54），非节假日皮质醇为（117.1±111.6）ng/g（n=112），两者也无显著差异性（Z=-1.903，p=0.057）。虽然雌雄之间皮质醇在非节假日无明显差异（Z=-1.031，p=0.302），但在节假日存在显著的性别差异，雌性皮质醇水平明显高于雄性（Z=-3.749，p＜0.001）。

图1 假期与个体皮质醇水平的关系Fig.1 The relationship between vacation and individual cortisol levels

3.2 皮质醇的季节性变化

按气象划分法对季节进行划分，春季为3—5月，夏季为6—8 月，秋季9—11 月，冬季12—2 月，黄颊长臂猿皮质醇代谢随季节变化情况如图2 所示。雌性冬季皮质醇水平［（219.4±140.4）ng/g，n=31］明显高于春季［（117.9±82.6）ng/g，n=60，Z=-3.637，p＜0.001］、夏季［（92.5±48.1）ng/g，n=54，Z=-4.655，p＜0.001］、秋季［（103.8±53.9）ng/g，n=48，Z=-4.230，p＜0.001］，其他季节间无显著差异（Z≥-1.351，p≥0.177）；雄性冬季皮质醇［（196.4±194.2）ng/g，n=30］明显高于春季［（85.7±62.2）ng/g，n=45，Z=-2.796，p=0.005］、夏季［（84.8±28.7）ng/g，n=42，Z=-2.557，p=0.011］、秋季［（88.6±69.3）ng/g，n=55，Z=-2.773，p=0.006］，其他季节间无显著差异（Z≥-1.818，p≥0.069）；此外，处于同一季节皮质醇水平存在性别差异，春季和秋季雌性皮质醇要明显高于雄性（Z=-2.273、-2.718，p=0.023、0.007），而夏季和冬季两者间无显著差异（Z=-0.262、-1.196，p=0.793、0.232）。

图2 皮质醇的季节性变化Fig.2 Seasonal variations in cortisol of two individuals

3.3 皮质醇与发情的关系

分析发情期（以Vivi 雌激素E1G 作为发情程度指标）2 只黄颊长臂猿皮质醇水平变化（图3），共发现8 个完整的发情期。雌性皮质醇随时间变化趋势与雌激素相似，两者呈现显著正相关（r=0.790，p=0.011）；而雄性皮质醇与雌性雌激素间不存在相关性（r=0.027，p=0.944）。

图3 发情期雌性与雄性的皮质醇变化Fig.3 Cortisol changes in two individuals during estrus

4 讨论

在野生动物迁地保护中，圈养动物的福利一直是热点研究话题，为此“环境丰容”这一概念得以提出，并且从1982 年开始至今一直被应用于野生动物饲养管理中［14］，如玩具丰容和食物丰容可以有效地增加圈养北白颊长臂猿（Nomascus leucogenys）的日常行为表达包括采食行为与探索行为，并显著减少对游客的注意力以及减少刻板行为的发生［15-17］。环境丰容还可以显著减少长期单笼饲养食蟹猴（Ma-caca fascicularis）的异常行为发生［18］，此外还被应用于其他灵长类动物如川金丝猴［7］、黑猩猩［9］和北豚尾猴（Macaca leonina）［19］等种类，成效显著。本研究发现黄颊长臂猿在节假日的皮质醇水平与非节假日并未呈现出显著性差异，一定程度上反映出游客干扰（投喂、喊叫、挑逗等）并未对其产生较大的应激影响。究其原因，可能是2 只黄颊长臂猿长期处于动物园展区环境（至少有8 年的经历），已经对游客干扰产生了一定适应，在其他动物中也发现了类似的适应特性［20］。但有研究发现，长期处于圈养状态下的大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）却并未产生这种适应，仍对游客产生一定的应激性［21］。李金燕等［22］也报道了在生态旅游开展中游客噪声会对滇金丝猴产生一定的干扰。这种种间差异反映出动物对应激源的认知受生活经历、遗传和行为等因素影响［23］。某些物种在长期处于某种特定环境下可能会对某一个或多个干扰因子产生适应，进而不会将这些外来刺激当作应激源。

黄颊长臂猿皮质醇代谢受季节影响，冬季皮质醇水平明显高于其他季节（图2）。一般认为，皮质激素分泌的季节性模式与代谢有关，这种模式被归因于冬眠期间储存的脂肪和蛋白质分解代谢的需求，如美国黑熊（Ursus americanus）在冬季和春季皮质醇水平要明显高于夏季水平［24］；对于不具有冬眠特征的物种如大熊猫也发现了相同的模式，被认为可能是光周期触发每年一次季节性繁殖模式，行为或生殖需求促进机体维持较高的皮质醇水平［24-25］；小型动物还发现了神经和内分泌因素均导致免疫功能发生季节性改变，冬季皮质醇分泌与免疫功能增强有关［26］。皮质醇季节性变化与动物的能量代谢、免疫、繁育、遗传和光周期等诸多因素相关，各因素间又受协同作用的影响，因此本研究就该问题很难进行深入考究。考虑到雌性与雄性未有繁育史，由此作简单推测，黄颊长臂猿季节性分泌模式可能与冬季的严寒使得机体分泌皮质醇促进蛋白质、脂肪分解以满足自身能量需求和增强免疫能力有关。有研究发现，在寒冷的秋冬季节，长臂猿通过减少活动量以及提高采食量、增加采食时间的方式来补充能量损失以减少寒冷带来的刺激［27］。

本研究还发现发情期的雌性黄颊长臂猿皮质醇变化趋势与雌激素保持高度一致（图3），与大熊猫的研究结果［28］一致，表明了肾上腺活动的变化很可能反映了与生殖阶段相关的能量需求和发情相关活动水平。不仅如此，在啮齿类动物身上也发现皮质醇可以增强雌性激素启动，并促性腺激素分泌和排卵［29］。但雄性黄颊长臂猿并未表现出相似的情况，雄性与雌性未在皮质醇水平上表现出同步性。就此作简单推断，雄性在此期间或许并未表现出明显的性行为（试验人员与饲养人员也未曾发现），导致这种原因可能与雄性自身繁殖能力、外界干扰有关。Lukas 等［30］研究指出雄性白颊长臂猿对人类产生强烈的依恋性，进一步降低了性熟练程度，或许最终会导致雄性性行为发育不良以至于交配能力的丧失。本研究也发现雄性黄颊长臂猿与白颊长臂猿具有相似的情况，雄性更容易被游客吸引（未做详细记录），这在一定程度上也解释了在节假日雄性皮质醇显著低于雌性的原因（图1）。李宏兵等［31］研究发现处于相对安静繁殖区的白颊长臂猿的社会性行为频次明显高于喧闹的展出区。喧闹的环境会制约性行为的表现，这或许也是原因之一。本研究鉴于样本量偏少，存在一定的不确切性，需要今后深入研究，仅为未来相关研究提供参考。鉴于以上结论，建议为参与繁育计划的黄颊长臂猿提供一个安静、舒适的饲养环境，减少游客干扰；尽量提供多元化食物，将投喂方式由定时改为不定时，并在秋冬季节适当提供一些高能量的食物；持续开展环境丰容以进一步提高动物福利。