乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA 清除的研究进展

李成，莫雪，牛文霞，李明明，付丽娟，，3

1.湖北省孝感市中心医院，湖北孝感 432000；2.厦门大学附属翔安医院感染科，福建厦门 361000；3.厦门市感染性疾病质量控制中心，福建厦门 361000

慢性乙型肝炎是乙型肝炎病毒持续感染引起的以肝脏慢性炎症性改变为主要特征的一类传染病。长期慢性感染会导致肝纤维化、肝硬化、肝癌等终末期肝病的发生，严重危害人民群众的健康。慢性乙型肝炎病毒感染依然是全球公共卫生健康问题之一。据世界卫生组织统计，全球约有20 亿人曾经感染过HBV，近2.57 亿人为慢性感染者，其中每年约78 万人死于HBV 相关肝病及其并发症，严重威胁人类健康[1]。接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染最有效的途径。乙肝疫苗在我国广泛接种使得新发感染率逐年下降，我国现在属于HBV 中度流行区的国家，目前我国有7 400 万人为HBV 携带者[2]。

当前临床上使用的抗乙肝病毒治疗药物主要为聚乙二醇化干扰素α（polyethylene glycol interferon, PEG-IFNα）和核苷（酸）类似物[nucleos(t)ide analogues, NAs][3]。虽然这两类药物均能有效抑制HBV 复制，阻止炎症进展和改善预后。但两者都不能影响最初形成的共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA），同时对感染肝细胞核内现存的cccDNA 没有清除作用，也不能对整合到肝细胞染色体上的病毒基因起到清除作用。因此，患者往往需要长期使用抗乙肝病毒药物治疗来抑制病毒复制。目前临床上使用的抗病毒治疗方案都无法彻底地清除感染肝细胞核内cccDNA，难以实现慢性乙型肝炎的完全治愈[4]。为了达到彻底治愈HBV 感染的目标，关键在于可以靶向根除感染肝细胞核内cccDNA 的抗病毒治疗策略[5]。本文对HBV cccDNA 清除的研究进展进行综述，旨在寻找彻底清除cccDNA 的方法。

1 靶向抑制cccDNA 的形成

感染肝细胞核内的cccDNA 是HBV 感染肝细胞后由双链环状不完全闭合DNA（relaxed circular DNA, rcDNA）在核内利用细胞的DNA 损伤修复机制转化形成的。病毒以cccDNA 为模板转录合成所有的RNA 和子代病毒基因组。具有超螺旋结构的cccDNA 与细胞组蛋白、非组蛋白等结合形成微染色体稳定存在于被感染肝细胞核内，加之目前缺乏直接靶向cccDNA 的抗病毒治疗药物，使得HBV 能长期存在于乙肝患者肝脏内并导致慢性感染。因此，研究HBV cccDNA 的形成机制和HBV 与宿主相互作用对于研发清除cccDNA 药物、治愈慢性乙型肝炎具有重大意义。

研究表明进入肝细胞核内的rcDNA 转化形成cccDNA 的过程至少包括负链5’端病毒聚合酶、负链5’端和3’端的冗余片段、正链5’端的RNA 引物的去除和正链3’端缺口及双链间隙的填补[6]。在此过程中，酪氨酰-DNA-磷酸二酯酶2（tyrosyl-DNA-phosphodiesterase 2, TDP2）[7]参与去除rcDNA负链5’端共价连接病毒聚合酶的过程，促进rcDNA向cccDNA 的转化。然而，在另一项研究中发现TDP2 并不是体内cccDNA 形成过程中不可或缺的宿主DNA 修复酶[8]。Flap 核酸内切酶1（flap endonuclease 1, FEN1）[9]结合并切割rcDNA 负链5’端的冗余片段促使rcDNA 向cccDNA 的转化。DNA 聚合酶κ、α、DNA 连接酶（DNA ligases, LIG）参与cccDNA形成过程中DNA 缺口的修复[10-12]，其中细胞内cccDNA 扩增需要DNA 聚合酶α、δ 和ε 的参与，HBV从头感染过程中需要DNA 聚合酶κ 和λ 的参与。此外，研究发现DNA 拓扑异构酶、共济失调毛细血管扩张与RAD3 相关（ataxia telangiectasia and RAD3-related, ATR）途径也参与了cccDNA 形成过程中rcDNA 的损伤修复[13-14]。

最近一项由rcDNA 底物经过酵母和人肝癌细胞提取物及纯化人蛋白修复形成cccDNA 的实验筛选确定了rcDNA 修复形成cccDNA 过程中的5 个关键宿主因子：增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）、复制因子C 复合物（replication factor C complex, RFC）、POLδ、FEN1 和LIG1[15]。rcDNA 向cccDNA 转化过程中正链和负链缺口修复所需要的宿主因子不完全相同[16]，其中正链缺口修复需要PCNA、RFC、POLδ、FEN1 和LIG1 这5 个宿主因子的参与，而负链的修复只需要FEN1 和LIG1 的参与。这对于全面了解rcDNA 是如何转化形成cccDNA 的过程及研发新的靶向药物至关重要。

脱蛋白的松弛环状DNA（deproteinized relaxed circular DNA, DP-rcDNA）是rcDNA 转变形成cccDNA 过程中重要中间产物。通过HBeAg 的比例表达来监测cccDNA 水平的细胞筛选策略研究发现两种结构相关的双取代磺酰胺（disubstituted sulfonamides, DSS）（CCC-0975 和CCC-0346），DSS 化合物通过降低HepDES19 细胞中DP-rcDNA 的水平抑制rcDNA 向cccDNA 的转化来减少cccDNA 的生物合成[17]。DSS 化合物有望成为临床治疗HBV 的新型药物。一项对包含大约1 000 个参与DNA 损伤反应、表观遗传和核酸结合途径的基因文库进行siRNA 筛选研究确定了剪接体成分前mRNA 加工因子31（pre-mRNA processing factor 31, PRPF31）参与cccDNA 的形成[18]。该研究表明PRPF31 与HBx 共定位于细胞核内，只有当PRPF31-HBx 共同过表达时cccDNA 的形成才会显著增加。PRPF31-HBx 复合物如何促进cccDNA 形成机制有待进一步研究。抑制PRPF31 与HBx 之间的相互作用可以作为抗HBV 治疗的新靶点。

2 沉默cccDNA 的转录

肝细胞核内的cccDNA 并不都是以简单的超螺旋结构游离形式存在，部分与组蛋白、非组蛋白等结合形成微染色体结构。因此cccDNA 的转录受到微染色体上组蛋白及非组蛋白的化学修饰调控作用的影响，其中包括DNA 甲基化、组蛋白及非编码RNA 修饰。HBV cccDNA 包含3 个CpG 岛，该区域的甲基化状态可以参与调控HBV 复制和转录，这为CpG 甲基化在调节HBV cccDNA 转录功能提供了新的见解[19]。此外，组蛋白甲基化、乙酰化等修饰也参与调节cccDNA 的转录过程。陈娟等[6]通过筛选并确定了沉默交配类型信息调控2 同源物3（silent mating type information regulation 2 homolog 3, SIRT3）可以通过与组蛋白甲基转移酶协同作用来限制cccDNA 转录所需要的宿主因子而起到沉默cccDNA 转录的作用[20]。这为SIRT3 将来被应用于治疗慢性乙型肝炎提供了相关的理论依据。Pollicino T[21]等研究表明cccDNA 的转录水平受H3 和H4组蛋白乙酰化水平的影响，其乙酰化可以促进cccDNA 的转录，反之则抑制cccDNA 的表达。有研究发现组蛋白脱乙酰基酶11（histone deacetylase 11, HDAC11）被招募到cccDNA 中，通过降低与cccDNA 结合的H3 组蛋白赖氨酸H3K9 和H3K27 的乙酰化水平来抑制cccDNA 的转录[22]。最近一项研究报道显示，组蛋白乙酰基转移酶1（histone acetylbased transferase 1, HAT1）可以促进微染色体的组装和组蛋白乙酰化修饰，由于HAT1 可以使新合成的组蛋白发生乙酰化修饰，使得新合成的组蛋白上的乙酰化状态在宿主细胞中核小体的组装过程中起到重要作用，进一步解释了cccDNA 调控的分子机制，这为宿主HAT1 信号调节游离病毒基因组复制机制提供了新的思路[23]。新的一项研究发现SIRT7 通过与HBx 相互作用催化与cccDNA 结合的组蛋白H3K122 脱琥珀酰化在表观遗传上沉默cccDNA 的转录[24]。该项研究将SIRT7 确定为研发抗HBV 感染的新型表观遗传治疗提供潜在靶点。

除了DNA 甲基化及组蛋白修饰，非组蛋白也可以参与cccDNA 的表达调控。HBx 可以通过与宿主蛋白的相互作用降解维持染色体结构复合物Smc5/6 来消除Smc5/6 对cccDNA 转录的抑制作用，从而促进cccDNA 的转录[25]。一项在感染HBV 的原代肝细胞研究中发现了一种噻唑类抗感染药硝唑尼特（nitazoxanide, NTZ）可以有效抑制HBx 和损伤特异性DNA 结合蛋白1（damage specific DNA binding protein 1, DDB1）的相互作用，进而能够恢复Smc5蛋白表达来沉默cccDNA 的转录及相关病毒蛋白的产生[26]。靶向HBV 相关病毒与宿主蛋白之间相互作用的NTZ 可能为治疗慢性乙型肝炎提供新的抗病毒方案。另一项研究发现具有先天传感器来识别和结合细胞核中cccDNA 功能的干扰素诱导蛋白16（interferon-inducible protein 16, IF16）通过靶向作用于cccDNA 上的干扰素刺激反应元件（interferonstimulated response element, ISRE）进而表观遗传抑制cccDNA 的转录[27]。该项研究表明IF16 可以作为治疗HBV 感染的潜在靶点。通过表观遗传修饰途径沉默cccDNA 的转录来抑制HBV 的复制，这为抗HBV 药物的研发提供新的思路。

3 诱导cccDNA 的降解

HBV 慢性感染患者体内的cccDNA 是不断变化并维持相对平衡。机体可以通过细胞溶解和非细胞溶解两个途径来降解部分cccDNA。细胞溶解途径是通过免疫损伤和细胞凋亡过程使被感染的肝细胞发生溶解破坏，cccDNA 从细胞内释放出来被巨噬细胞吞噬或与抗体结合形成免疫复合物后被巨噬细胞吞噬，从而清除cccDNA。相反，非细胞溶解途径是在免疫应答过程中产生的细胞因子（如干扰素、肿瘤坏死因子和白细胞介素等）在不发生细胞溶解的前提条件下清除细胞内的cccDNA。Xia Y等[28]研究表明T 细胞产生的IFNγ 和TNFα 通过诱导cccDNA 脱氨基作用降低肝细胞内cccDNA 的表达水平。另外，有研究发现高剂量IFNα 和淋巴毒素β受体分别诱导胞嘧啶脱氨酶3A 和3B 的表达，通过HBV 核心蛋白与cccDNA 的相互作用，使cccDNA 发生脱氨基作用形成脱嘌呤/脱嘧啶位点，进而降解cccDNA[29]。随后，Bockmann JH[30]等研究发现与IFNα 相比，IFNβ 和IFNλ 可以更为持久地诱导载脂蛋白B 信使RNA 编辑酶催化多肽样（apolipoprotein b messenger rna-editing enzyme-catalytic polypeptidelike, APOBEC）脱氨酶的表达，使肝细胞内cccDNA发生脱氨基作用造成G-A 序列的变化来降解cccDNA。

最近研究发现IFN 通过非细胞溶解途径诱导cccDNA 的降解过程依赖于干扰素刺激基因20（interferon-stimulated Gene 20, ISG20）[31]。ISG20 是促使IFN 诱导cccDNA 降解的核酸酶，这为研发抗HBV 药物提供潜在靶点。此外，研究还发现转化生长因子β 在肝细胞中可以通过激活胞苷脱氨酶来诱导cccDNA 脱氨基作用进而降解cccDNA[32]。目前，随着对细胞因子的研究及PEG-IFNα 在临床上慢性乙型肝炎表现出的治疗效果来看，细胞因子相关药物的研发将成为临床上治疗HBV 感染新型抗病毒治疗方案。然而，有关细胞因子如何通过非细胞溶解途径来降解cccDNA 机制仍需要深入进行研究。

近年来随着基因编辑技术的快速发展并在生物医学研究领域中得到广泛应用，部分研究学者在构建的体外细胞或动物模型中采用基因编辑技术方法研究cccDNA 降解机制，其中包括锌指核酸酶（zinc finger nuclease, ZFNs）[33]、转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator like effector nucleases, TALENs）[34]和成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR 相关蛋白9（CRISPR/Cas9）技术[35]。但是，由于目前基因编辑技术存在脱靶效应和缺乏相应的体内递呈载体，使得靶向降解cccDNA 的基因编辑技术在临床上无法得到有效的应用，需要进行相关研究并找到解决这些问题的对策。

4 结语

HBV 复制周期的复杂性和cccDNA 的稳定性是治疗慢性乙型肝炎达到完全治愈的难题。随着对HBV 在宿主肝细胞内复制周期和cccDNA 形成过程的深入研究，这将为作用在HBV 复制周期各阶段潜在靶点的新型抗病毒药物的研发提供新的思路。因此，应用多途径的免疫治疗联合多靶点的药物治疗是目前抑制HBV 基因组表达并促使cccDNA 清除的有效抗病毒策略[36]。随着国内外学者们对HBV与宿主相互作用是如何参与cccDNA 形成确切机制的不断探索和研究，相信未来一定会实现对cccDNA 的清除和慢性乙型肝炎的治愈。