套袋提升椪柑果实品质的作用机制

2023-08-15石莹陈思怡曾译可唐俊李迪平李国敬黄先彪李春龙谢宗周刘继红

中国农业科学 2023年14期

石莹，陈思怡，曾译可，唐俊，李迪平，李国敬，黄先彪，李春龙，谢宗周，刘继红

套袋提升椪柑果实品质的作用机制

1华中农业大学/果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室，武汉 430070；2当阳市特产技术推广中心，湖北当阳 444100；3邵阳市农业科学研究院，湖南邵阳 422002

【背景】椪柑（）是我国重要的宽皮橘类型，‘鄂柑一号’是湖北省当阳市发展面积较大的椪柑品种，但存在采收过早和果实品质未达最佳等问题，不利于其市场销售。因此，需要研发应用于‘鄂柑一号’椪柑延迟采收和完熟的栽培技术。【目的】探究套袋对提升‘鄂柑一号’椪柑果实品质的作用，并基于糖酸代谢基因表达水平的变化解析其机制。【方法】试验在湖北省当阳市半月镇‘鄂柑一号’椪柑园进行，比较套袋果实和未套袋（对照）果实的品质，主要分析果皮亮度及色泽、可溶性固形物含量、可滴定酸含量，通过气相色谱法分析可溶性糖和有机酸含量，通过qRT-PCR分析比较二者糖酸代谢相关基因表达水平差异。【结果】套袋加快了果皮色泽参数a*、b*和柑橘色泽指数（CCI）变化，提升了果皮亮度（L*），显著降低了果皮硬度；套袋显著提高了采收时期椪柑果实可溶性固形物含量，其中蔗糖、果糖和葡萄糖含量显著增加；气相色谱分析发现，柑橘果实有机酸以柠檬酸为主，套袋果实柠檬酸含量稍高于对照；实时荧光定量PCR分析表明，套袋果实蔗糖合成相关基因、和表达水平显著高于未套袋果实，而柠檬酸降解相关基因表达水平显著下调。【结论】套袋可能改变了袋内果实所处环境的温度、湿度，上调可溶性糖合成基因表达，促进糖积累，从而提升椪柑果实品质。

椪柑；套袋；果实品质；糖酸代谢

0 引言

【研究意义】我国柑橘熟期主要集中在每年11月初至第二年2月期间，其中中熟品种栽培比例较高，2020年中熟柑橘种植比例超过50%[1]，中熟柑橘品种生产过剩会影响果农的收益，阻碍我国柑橘产业的健康发展。此外，我国中熟柑橘与欧盟部分国家的柑橘成熟期重合导致出口受限，而在国外对柑橘需求较为迫切的3—10月间，我国柑橘产量较低，无法适时满足国外柑橘进口需求，甚至需要从其他国家以较高价格进口柑橘供国内市场消费。因此，进一步采取措施延长上市时间，除继续调整柑橘熟期结构外，柑橘的贮藏保鲜工作也是重中之重[2]。【前人研究进展】柑橘的贮藏方式主要有简易贮藏保鲜[3]、冷藏保鲜[4]、气调贮藏保鲜[5]、生物技术保鲜[6]、基因工程技术保鲜等[7]，成本低、效益高、节能且安全的贮藏保鲜技术也在持续探索中。留树保鲜是自然保鲜方法的一种，将果实留树至充分成熟再采收，或延缓果实衰老过程从而达到延迟采收[8]。柑橘留树保鲜的优势在于让果实充分成熟，能够表现出品种固有的品质特性，从而提高果实品质[9]；在柑橘淡季新鲜下树，畅销且增值，减轻了集中扎堆上市的压力，提高了柑橘产业的质量和效益，有助于柑橘产业的健康可持续发展。【本研究切入点】套袋是留树保鲜过程中常用的措施，能够起到物理防护作用，减少虫鸟危害、降低病果率、防止农药与果面接触、防止树枝划伤等[10]，也能在一定程度上改变果实的微环境[11]。但目前对不同气候条件、不同地理位置是否适宜采取套袋的方法比较模糊。【拟解决的关键问题】本研究以湖北省当阳市种植较多的椪柑品种‘鄂柑1号’为试材，探究套袋果实品质的变化，并基于糖酸代谢基因表达分析初步揭示其作用机制，为果实套袋延期采收的方法提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试材及取样

试验椪柑果园位于湖北省宜昌市当阳市半月镇龙台村凤凰山（北纬30°40′46″，东经111°50′21″，海拔130 m），树龄18年，以枳（）砧为砧木嫁接‘鄂柑1号’，树冠高2.5 m，株距2.5 m，行距4.5 m，果园进行正常的肥水管理和病虫害防治。

2019年11月11日选取6棵生长势相近的椪柑植株为试材，试验设2个处理：套袋处理（套袋）3棵植株，每株选取果形端正、果实大小相近的100个果实进行套袋处理；另外选择3棵植株不套袋作为对照（CK）。选用防水透气的乳白色木浆纸质单层纸袋（什邡市润锋纸制品加工厂），套袋处理前全园喷施一次农药防治病虫害，药干后进行套袋操作。套袋时从下往上将整个果实全部套入袋中，使果实位于纸袋中央，扎紧袋口铁丝防止雨水进入。套袋第0、10、20、30、40和55天分别采样，在每棵植株同一高度上，4个方向各随机采1个果实。样品当天带回华中农业大学进行品质分析，测定果皮色泽、硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸含量，每个果实去除靠近果蒂和果脐部分的剩余果实上分别取下囊瓣、果皮，用液氮速冻后立即置于-80 ℃超低温冰箱备用，所有时期取样完成后使用气相色谱分析可溶性糖和有机酸含量，并分析糖酸代谢相关基因的表达水平。

1.2 果实外观品质分析

使用色彩色差仪（*cm-5，美能达，Japan）测量果面色泽参数L*、a*和b*；使用质构仪（*TA. XT. Plus，Stable micro systems，UK）测定果皮硬度。

1.3 可溶性固形物、可滴定酸、可溶性糖和有机酸含量分析

可溶性固形物使用PAL-1手持折光测糖仪（Atago，Japan）测定；可滴定酸使用GMK-835F水果酸度计（G-WON，South Korea）测定。可溶性糖和有机酸含量采用气相色谱法[12]测定，使用安捷伦GC-7890B气相色谱仪，HP-5色谱柱（5%-Phenyl- methyl polysiloxane. 30 m×0.25 μm×320 μm i.d.）。

1.4 总RNA提取及荧光定量PCR

用PLANT pure通用植物总RNA快速提取试剂盒（Aidlab公司）提取果肉总RNA，实时荧光定量PCR采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（ABI，USA）检测基因表达量，方法参照说明书。采用QuantStudio 7 Flex system（Applied Biosystems，美国）荧光定量分析仪进行反应，基因的相对表达量采用2−∆∆CT方法[13]计算，基因引物信息见表1。

表1 定量分析所用引物

1.5 数据处理

套袋工作重复了3年，提升果实品质效果一致，因此，只在其中一年进行了数据采集和分析。采用Microsoft Excel 2016和SPSS进行数据分析，依据LSD测验比较显著性差异。

2 结果

2.1 果实外观品质比较

观察跟踪果实的色泽变化，套袋果实的L*均值高于CK，且在30 d表现出显著差异，套袋显著提升了果皮亮度，40 d时，二者的L*值都有所降低（图1-A）；果皮色泽参数a*快速增加，套袋处理10 d后极显著高于CK，此后的差异逐渐减小（图1-B）；果皮色泽参数b*值小幅上升，套袋果实的b*均值高于CK且在套袋后30 d表现出显著差异（图1-C）；0 d时套袋果实的色泽饱和度（CCI）极显著低于CK，但套袋后快速升高，在套袋10 d后显著高于CK，此后二者之间没有表现出显著性差异（图1-D）。果实的色泽变化说明套袋在一定程度上加快了椪柑果实的着色进程，10—30 d时套袋果实具有更好的外观品质，此后优势逐渐消失。

果实成熟后期果皮硬度逐渐降低，套袋后表现为快速下降。套袋55 d采收时套袋果实的果皮硬度仅为510.97 g，显著低于CK的567.68 g（图1-E），套袋显著降低了果皮硬度。根据果实的表型可以看出，套袋果实后期依然平滑有光泽，而对照果实发生明显的果面塌陷，组织柔软，明显受到严重冻害（图1-F）。

*：P<0.05；**P<0.01；***：P<0.001。下同 The same as below

2.2 果实内在品质比较

果实生长发育后期可溶性固形物含量（TSS）持续增加，套袋果实的TSS积累速度大于CK，套袋55 d后达到14.9%，极显著高于CK的13.0%（图2-A），套袋显著提升了椪柑果实的TSS；套袋时为11月11日，可滴定酸含量（TA）已经大幅降低，因此套袋后TA随着果实的进一步成熟仍略有降低，但变化幅度较小，此过程中套袋果实的TA均值高于CK且在套袋后55 d表现出显著差异，果实套袋在一定程度上阻止了TA的降低（图2-B）。

使用气相色谱分析套袋和CK果实的可溶性糖和有机酸含量。0 d时套袋果实和CK果实的蔗糖含量分别为39.66和36.66 mg∙g-1，二者之间差异不显著；55 d时，套袋果实的蔗糖含量达到77.24 mg∙g-1，极显著高于CK果实（图3-A）。0 d时，套袋果实的果糖和葡萄糖的平均含量分别为15.58和11.49 mg∙g-1，分别低于CK的17.77和14.57 mg∙g-1，果实套袋后表现出更快的果糖和葡萄糖积累速度，40 d后套袋果实的果糖和葡萄糖含量开始显著高于CK，套袋55 d时这种差距变得更为明显，此时套袋果实的果糖含量和葡萄糖含量分别为29.63和23.95 mg∙g-1，均显著高于CK（图3-B、C），套袋显著提升了椪柑果实的蔗糖、果糖和葡萄糖含量，与TSS的变化趋势一致。

图2 套袋对椪柑果实可溶性固形物含量（A）和可滴定酸含量（B）的影响

图3 套袋对椪柑果实蔗糖（A）、果糖（B）、葡萄糖（C）和柠檬酸（D）含量的影响

另外，还分析了果实的有机酸含量，发现以柠檬酸为主（结果未展示）。CK果实中柠檬酸含量基本稳定，而套袋果实柠檬酸有所积累，20和55 d，套袋果实和CK果实中的柠檬酸含量分别为11.31、7.28和9.79和8.58 mg∙g-1，进一步成熟过程中，套袋果实柠檬酸含量稍高于CK（图3-D）；套袋和CK果实的苹果酸含量基本保持稳定，奎宁酸含量随着果实成熟而降低，套袋果实中的苹果酸、奎宁酸含量高于CK，但因其含量极少，对有机酸变化的贡献较小（结果未展示）。因此，套袋提高了柠檬酸的含量，与TA含量变化趋势一致，表明套袋处理一定程度上阻止了酸的降解。

2.3 糖酸代谢相关基因的表达量变化

套袋果实中表达水平在处理40 d后显著上调，的表达水平变化最明显，在套袋处理55 d后显著高于CK，但套袋果实中和的表达水平分别在套袋20 d和套袋55 d时低于CK，与和的表达量变化相反（图4-A）；套袋后，和的表达水平逐渐上调且在套袋果实中的表达水平显著高于CK，而和的表达水平逐渐降低，且套袋果实中和的表达水平显著低于CK，但上调的变化程度最大（图4-B）。

套袋处理的柠檬酸降解相关基因表达水平均较低。其中和的表达水平在套袋55 d后显著高于CK（图5-A）。s的表达水平变化也较小，套袋处理40 d后，在套袋果实中的表达水平显著高于CK；套袋处理20 d后，在套袋果实中的表达水平显著高于CK；而的表达水平变化情况相反，套袋40 d后在套袋果实中的表达水平低于CK（图5-B）。s的表达水平在果实发育后期变化较小，套袋20 d和55 d时的表达水平显著高于CK，而和的表达水平在CK和套袋果实中没有显著差异（图5-C）。柠檬酸降解相关基因在套袋果实中的表达水平整体略高于CK，仅的表达水平在套袋40 d时显著下调，但柠檬酸降解相关基因的表达水平整体较低。

3 讨论

3.1 套袋改善了果实外观品质

套袋通过物理隔离保护果皮免受机械伤害，从而提升了果实表面光洁度和亮度。露天条件下白天温度持续升高，至正午达到最高温度后开始逐渐降低，湿度变化则相反，而套袋显著提高了袋内微域的平均温度和湿度[17-18]。有研究发现遮光使柑橘果皮中的叶绿素含量迅速下降且类胡萝卜素积累缓慢[19]，套袋能够促进‘三红蜜柚’提前退绿，增加成熟期果实的果皮番茄红素，显著提高果面的色泽饱和度[20]；套袋使红肉脐橙果皮叶绿素含量下降，有利于黄色、红色的呈现[21]；套袋能明显提早柠檬果实着色[22]，改善纽荷尔脐橙果实的外观品质[23]。柑橘果皮呈色主要受到叶绿素和类胡萝卜素含量以及二者比值的影响[24]，套袋通过提高温度、湿度和遮光效果影响果皮中叶绿素和类胡萝卜素的合成，加速了椪柑果实的着色，套袋后期随着果实衰老和温度持续降低，套袋和对照果实的外观品质都有所下降，二者之间差异逐渐减小，套袋对果面着色影响的具体作用机制还有待进一步分析。

3.2 套袋促进了糖的积累

内在品质的变化表明，套袋处理提高了椪柑果实的可溶性固形物含量，蔗糖、果糖和葡萄糖含量较未套袋果实都有提高。‘纽荷尔’脐橙[25]、椪柑[26]、‘宫川’温州蜜柑[27]上都有类似的研究结果，套袋果实的可溶性固形物含量明显上升，风味更佳，果实品质得到显著改善。套袋使果实实现了充分成熟，能够表现出品种固有的品质特性；另一方面通过提高温度、改变气体环境影响果实的代谢进程和光合产物的分配及积累，套袋影响果实的光照量，也可能通过反馈调节提高果实库强，增加果实从叶片中分配的光合产物，此外渗透调节也可能诱导一些初生代谢物的含量发生变化从而达到增糖提质的效果。果实获得光合产物的能力在很大程度上受库强控制[28]，分析果实中蔗糖代谢相关基因的表达水平，发现蔗糖合成相关基因、和、在套袋果实中显著上调，这可能增强了果实的“库”调运同化物的能力[29]，本研究认为蔗糖代谢相关基因通过调控果实的库强大小对蔗糖的积累发挥着重要作用，显著提高了果实的可溶性糖含量。

图4 套袋对椪柑果实蔗糖磷酸合成酶基因CsSPSs（A）和蔗糖合成酶基因CsSSs（B）表达水平的影响

图5 套袋对椪柑果实ATP-柠檬酸裂解酶基因CsACLs（A）、顺乌头酸酶基因CsACOs（B）、异柠檬酸脱氢酶基因CsNADP-IDHs （C）表达水平的影响

3.3 套袋对酸含量的影响

套袋处理一定程度上阻止了椪柑果肉中可滴定酸的降解，与衢州[30]、临海市[31]等地的研究结论相反，本研究通过气相色谱分析发现套袋果实的柠檬酸含量相较对照更高，佐证了套袋果实中可滴定酸的降解速度相较对照更慢。有机酸的消耗是导致柑橘果实风味和品质下降的主要原因[32]，本研究中套袋延缓了椪柑果实可滴定酸的降解，不仅能维持风味，还有利于储藏。套袋的遮光作用延缓了果实的发育，有利于酸的积累[33]，也可能与试验地区当年的气候相关。本研究分析果实中柠檬酸代谢相关基因的表达水平，发现柠檬酸降解相关基因的表达水平下调，与柠檬酸含量的变化情况相符，推测套袋果实中表达水平下调导致乌头酸酶活性受抑制，从而一定程度上阻止了柠檬酸分解转化为顺乌头酸[34]。但柠檬酸代谢相关基因的表达水平整体较低，而果实中有机酸的代谢过程极为复杂，柠檬酸含量还受遗传特性、光照、水分、温度、营养元素、叶果比等很多因素的共同调控[35]，套袋条件下果实降酸的主要途径有待进一步分析和探究。

4 结论

椪柑套袋可改善果实外观，同时改变了袋内果实所处环境的温度、湿度，上调了可溶性糖合成基因表达，促进糖积累，从而提升椪柑果实品质，可延长留树时间至柑橘淡季新鲜采摘上市。综上，果实套袋可以作为湖北地区椪柑的一种延迟采收和完熟栽培技术进行进一步推广和应用。

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Mechanism Underlying the Improved Quality of Bagged Fruits in Ponkan

1Huazhong Agricultural University/National Key Laboratory for Germplasm Innovation & Utilization of Horticultural Crops, Wuhan 430070;2Technology Promotion Center of Dangyang Special Agricultural Industry, Dangyang 444100, Hubei;3Shaoyang Academy of Agricultural Sciences, Shaoyang 422002, Hunan

【Background】Ponkan () is an important loose-skin tangerine in China. Egan No. 1 Ponkan is widely grown in Dangyang City, Hubei Province. When this cultivar is used for producing fruit, the major problem is that advanced harvesting leads to undesirable fruit quality, and thus, to a negative impact on consumer appeal. Therefore, the industry has a critical need for the technologies that allow growers to delay harvest until Egan No. 1 Ponkan fruit is fully mature. 【Objective】In this study, whether bagging improves the quality of fruit produced by Egan No. 1 Ponkan was tested, and the underlying mechanism by examining the expression levels of genes involved in sucrose and citric acid metabolism was analyzed. 【Method】The experiment was conducted in orchards that produce Egan No. 1 located in Banyue Town, Dangyang City, Hubei Province, to compare the qualities of fruit that were produced after bagging to control fruit that was not bagged. The indexes were compared, including peel brightness (L*), color parameters a*, b*, citrus color index (CCI), total soluble solids, titratable acids, soluble sugars and organic acids. In addition, qRT-PCR was used to analyze the expression levels of the genes associated with sucrose and citric acid metabolism. 【Result】The bagging induced changes in peel color parameters, including changes in a*, b*, CCI, increased L*, and significantly reduced peel firmness. The bagging significantly increased the total soluble solid content when the fruit was harvested, and the sucrose, fructose and glucose levels were significantly elevated. A gas chromatography analysis showed that the levels of citric acid, the major organic acid in citrus fruits, was slightly higher in the bagged fruits relative to the control fruit. The qRT-PCR analysis showed that the expression levels of three genes associated with sucrose biosynthesis (,and) were significantly higher in the bagged fruit relative to the control fruit. In contrast, the expression levels of genes implicated in citric acid catabolism, such as, were remarkably downregulated in the bagged fruit. 【Conclusion】Taken together, these data indicated that the bagging improved the quality of Ponkan fruit possibly by changing the ambient temperature and humidity in the micro-milieu of the bagged fruits, which might have elevated the expression levels of genes that influence soluble sugar content and led to better sugar accumulation and improved fruit quality of Ponkan.

Ponkan; bagging; fruit quality; sucrose and citric acid metabolism