放射性核素探针在嵌合抗原受体T 细胞治疗显像中的应用

王培 王帅亮 朱华 杨志

1 贵州大学医学院，贵阳 550025；2 北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所核医学科，国家药监局放射性药物研究与评价重点实验室，恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京 100142

传统的治疗方法（如手术、放疗和化疗）在复发性和难治性肿瘤的治疗中往往存在着局限性，因此，免疫治疗、细胞治疗等新型肿瘤治疗策略正逐渐在临床肿瘤治疗中发挥巨大作用。其中，嵌合抗原受体T 细胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）疗法是近年来发展迅速的肿瘤过继性细胞疗法，尤其是在血液系统肿瘤的治疗中卓有成效。截至目前，美国食品药品监督管理局先后批准了6 种分别基于CD19 及B 细胞成熟抗原（BCMA）的CAR-T 疗法，极大地推动了血液系统肿瘤治疗策略的快速发展[1]。

CAR-T 通过与靶细胞形成免疫突触来表达促凋亡配体，并释放细胞毒性穿孔素和颗粒酶以及分泌促炎细胞因子（如干扰素α、干扰素γ 和白细胞介素2）来杀伤靶细胞。以CD19 为靶点的T 细胞疗法是目前CAR-T 疗法中最具代表性的形式，其通过基因工程改造自体T 细胞来表达特异性CD19 抗原受体，从而以高亲和力攻击CD19 阳性的恶性肿瘤细胞，并产生持久的反应[2]，尤其是在白血病和淋巴瘤的治疗中疗效显著[3]。但CAR-T 疗法治疗实体瘤的效果不尽人意，究其原因可能与肿瘤特异性靶点的难以确定、实体瘤复杂的免疫抑制微环境以及CAR-T 向肿瘤部分的转运有限等相关[4]。同时CAR-T 疗法通常可能会伴随着严重的不良反应，如靶点外毒性、脑毒性、神经毒性及严重的细胞因子风暴[5]。Ma 等[6]研究发现，可通过借助辅助诊断克服T 细胞特性和肿瘤环境所造成的障碍，即对CAR-T 体内动态进行监测，可更大程度地提高CAR-T 疗法在实体瘤中的疗效和安全性。

传统的影像学方法（如CT、MRI）可通过对肿瘤大小和形态变化的检测来提供肿瘤相关形态学信息，但无法检测T 细胞的空间信息[7]。外周血液检测虽可检测循环中过继转移的T 细胞、免疫标志物及相关细胞因子，但也不能提供T 细胞的空间分布状态和肿瘤特异性的扩张情况，因而难以准确量化T 细胞的肿瘤浸润程度[8]。肿瘤组织活检采样通常只包含一小部分肿瘤组织，因而也不能完全反映T 细胞在整个肿瘤中的浸润情况[7]。基于放射性核素的CAR-T 显像，可无创、实时、定量评价T 细胞在体内的分布，是提供T 细胞的空间信息、实现CAR-T 疗法动态监测的关键，对CAR-T 疗法的疗效预测及安全性评价具有重要的指导意义。

目前，基于放射性核素T 细胞显像的方法主要包括3 大类：直接标记显像、报告基因显像和内源性细胞显像，笔者将对这3 种显像方法的优劣势进行综述，并展望未来的发展方向。

1 直接标记显像

直接标记是指使用放射性核素对CAR-T 标记的技术，其标记过程简单，对细胞的操作较少。根据小分子和纳米颗粒能在体内滞留的特性，CAR-T 可使用小分子和纳米颗粒直接进行放射性标记。

1.1 基于小分子的标记

Parente-Pereira 等[9]用111In-tropolate 直接标记CAR-T 后，发现通过静脉注射时，111In-tropolate-CAR-T 分布于肺部、肝脏和脾脏中，但没有明显的肿瘤渗透，而通过腹腔或皮下注射时，111In-tropolate-CAR-T 主要滞留在注射部位，这为CAR-T 的直接标记提供了宝贵经验。

8-羟基喹啉（oxine）常被用于标记和示踪鼠源淋巴细胞[10]。Weist 等[11]将8-羟基喹啉（oxine）用于人源CAR-T 的放射性89Zr 标记，标记活度为70 kBq/百万细胞，该研究结果显示，89Zr-oxine-CAR-T 能在体内迁移，并能维持细胞因子的产生、肿瘤细胞毒性和体内抗肿瘤活性。

1.2 基于纳米颗粒的标记

Oh 等[12]研究发现，金纳米颗粒（gold nanoparticles，GNPs）可在细胞内滞留并具有生物安全性。Bhatnagar 等[13]利用GNPs 的这一特性来标记示踪CAR-T，然后通过静脉注射到健康小鼠体内行PET 显像，10 min 后显示，经GNPs标记后的CAR-T 富集于肺部，随后肝脏、脾脏的放射性活度逐渐增强。

上述研究均证实了直接标记CAR-T 是可行性的。然而，T 细胞对射线较为敏感，同时由于细胞分裂和死亡会导致放射性信号的稀释，以及标记细胞的死亡会被吞噬细胞吞噬而导致信号混叠等，会对CAR-T 在体内分布状态的评价产生干扰。此外，像GNPs 这样的纳米材料作为放射性核素的载体被引入细胞中是否会对CAR-T 造成潜在的生物毒性也有待研究验证。以上因素在一定程度上限制了直接标记CAR-T 显像策略的广泛应用。

2 报告基因显像

报告基因显像是一种非侵入式的基因显像方法，近年来已被用于CAR-T 的监测与定位。其原理是先将CAR-T在体外进行DNA 转导，构建重组DNA 使其共表达肿瘤特异性CAR 及报告抗原，然后注射与报告基因耦合的核素标记的探针进行显像。

2.1 酶基报告基因

可用放射性核素（如124I、14C、18F 等）标记单纯疱疹病毒1 型胸苷激酶（herpes simplex virus 1 thymidine kinase，HSV1-TK），该基因是目前唯一用于患者CAR-T 显像的酶基报告基因。Yaghoubi 等[14]使用HSV1-TK 作为报告基因在1 例Ⅳ级多形性胶质母细胞瘤患者中评价CAR-T 的分布状态，后又使用相同的报告基因成像开展临床试验（编号分别为NCT00730613 和NCT01082926），其中包括7 例传统治疗无效的复发性高级别胶质瘤患者，发现了CAR-T 向肿瘤部位的迁移。Ponomarev 等[15]使用基于HSV1-TK 报告基因的成像技术来监测依赖T 细胞受体（TCR）的活化T 细胞核因子（NFAT）介导的T 细胞活化，结果表明可以通过基于HSV1-TK 报告基因成像来实现对CAR-T 激活的监测。以上研究均证实了该报告基因显像的可行性，另外还有研究结果显示，使用哺乳动物类的报告基因结构可有效降低这种风险[16]。

大肠杆菌二氢叶酸还原酶（E.colidihydrofolate reductase，eDHFR）也是一种酶基报告基因，但其比HSV1-TK 的相对分子质量小（18 000 对46 000）。Sellmyer 等[17]使用eDHFR作为报告基因，以11C 和（或）18F-氟丙基甲氧苄啶（TMP）作为该报告系统的探针，应用在小鼠骨肉瘤模型中监测靶向二唾液酸神经节苷脂（GD2）的CAR-T，发现CAR-T 早期主要聚集在脾脏，晚期则主要向肿瘤内迁移。此外，基因测序结果显示，eDHFR 的免疫活性表位更少，且截短该酶可使其潜在的免疫原性降至最低，这在加深对CAR-T 动力学的理解和促进该报告基因显像系统的临床转化应用方面具有重要意义[18]。

2.2 基于协同载体的报告基因

人钠碘转运蛋白（human sodium-iodine symporter，hNIS）属于钠依赖转运蛋白家族，可用于调节碘和其他几种阴离子的跨膜转运[19]。大量的临床研究结果表明，hNIS 可作为报告基因可视化评估CAR-T 的体内分布。Emami-Shahri 等[20]使用hNIS/99TcmO4−报告基因/探针对前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen，PSMA）靶向CAR-T 进行成像和监测。Volpe 等[21]则构建了T4NT CAR-T 细胞，可以表达NIS 报告基因，同时还可靶向泛erbb 家族，该研究结果显示，免疫检查点程序化细胞死亡配体1（programmed cell death ligand-1，PD-L1）的表达水平会影响CAR-T 在不同肿瘤中的滞留，可见CAR-T 疗法在实体瘤的应用方面仍面临着诸多挑战。

2.3 基于受体的报告基因

生长抑素受体（somatostatin receptors，SSTRs）属于G蛋白偶联受体家族，在多数器官中的表达水平相对较低。SSTR 包含5 个不同的亚型，分别为SSTR1、2、3、4、5。其中SSTR2 对天然生长抑素和合成生长抑素类似物的亲和力最高，因此SSTR2 更多地被用于报告基因系统。Vedvyas等[22]使用SSTR2 作为报告基因，将人T 细胞共表达细胞间黏附分子1（ICAM-1）用于肿瘤靶向，建立了一种简单的方法来评估实体瘤中浸润的CAR-T 密度。

PSMA 是一种非免疫原性的人类蛋白，其仅在前列腺、肾脏和大脑等少数器官中表达，但内化野生型的PSMA与配体结合后会阻止其翻译为报告基因。因而Minn等[23]设计了一个N 端修饰的 PSMA 变体：tPSMA（N9del）（Nterminally modified PSMA variant，tPSMA），以防止PSMA内化和增加表面表达，并使用 tPSMA（N9del）/18F-2（3-{1-羧基-5-[（6-[18F]氟-吡啶-3-羰基）-胺基]-戊基}-脲基）-戊二酸（2-（3-{1-carboxy-5-[（6-18F-fluoro-pyridine-3-carbonyl）-amino]-pentyl}-ureido）pentanedioic acid，18F-DCFPyL）对 CD19 靶向 CAR-T 监测，结果显示，18F-DCFPyL 能与 PSMA 有效结合，并可使体内至少 2 000 个细胞可视化。

除了前述的SSTR2 和PSMA，另一种人源报告基因人去甲肾上腺素转运蛋白（human norepinephrine transporter，hNET）也可用于T 细胞可视化监测。Moroz 等[24]对4 种不同的报告基因系统[包括HSV1-TK、hNET、hNIS 和人脱氧胞苷激酶双突变体（hdCKDM）]检测报告基因转导的T 细胞的灵敏度进行了比较，结果表明hNET 报告基因系统是最灵敏的，因此，hNET 报告基因在T 细胞可视化成像方面极具应用潜力。

2.4 基于抗体的报告基因

Krebs 等[25]在之前的研究基础上，使用单链抗体可变片段（ScFv）构建了 1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid，DOTA）抗体报告1（antibody reporter 1，DAbR1）基因，使用DAbR1 和（或）（S）-2-（4-丙烯酰胺苯甲基）-DOTA （（S）-2-（4-acrylamidobenzyl）-DOTA，AABD）作为报告基因或探针在体内示踪CD19 靶向的CAR-T，分别用86Y 和177Lu 标记AABD 进行PET/CT 和SPECT/CT 显像，显像结果中均能观察到CAR-T 发出明显的放射性信号。但CAR-T 疗法可能会带来严重的不良反应，故此，该研究团队用DAbR1 作为自杀基因，经177Lu-AABD 治疗后，CAR-DAbR1 T 细胞受到辐射破坏或死亡，从而控制CAR-T 疗法可能带来的严重不良反应[25]。

综上，报告基因成像技术虽可在相对不受限制的时间内对体内CAR-T 进行无创可视化监测，但无法评估CAR-T聚集于肿瘤部位的激活状态，且一种CAR-T 报告系统仅能针对一种类型的疾病，CAR-T 产品获批授权应用时效长。HSV1-TK、大肠杆菌二氢叶酸还原酶（eDFHR）和DAbR1存在的潜在免疫原性，以及SSTR2、hNIS 和PSMA 在多个正常器官中的固有表达，都有可能导致背景干扰，从而在一定程度上限制了该方法的应用。

3 内源性细胞显像

内源性T 细胞显像可以反映细胞的激活和功能状态，是目前临床研究应用中较为成熟的技术[26-27]，但与CAR-T相关的研究还很少。

3.1 基于细胞表面标志物的成像

细胞表面标志物（如CD4、CD8、CD3 等）以及免疫检查点[如程序化细胞死亡受体1（programmed cell death 1，PD-1）、PD-L1 和细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4）]对于特定T 细胞群的体内显像具有重要意义[28]。其成像原理是通过构建特异性靶向T 细胞表面标志物的放射性核素探针，使用PET 或SPECT 显像来追踪靶细胞群，通过评估标志物的表达水平来反映细胞的免疫状态。

Larimer 等[29]使用89Zr 标记的抗CD3 抗体（89Zr-DFOCD3）对抗CTLA-4 治疗期间结肠癌T 细胞浸润进行定量，发现CD3 浸润表达水平与肿瘤的消退呈正相关。Rashidian等[30]开发了一种89Zr 标记的针对CD8 的聚乙二醇化单域抗体片段，可检测黑色素瘤和胰腺癌中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞。

癌细胞可以上调PD-L1 的表达水平，PD-L1 与T 细胞上的PD-1 相互作用，在抑制T 细胞活性中起主要作用[31]。89Zr-Dfnivolumab PET 可用来定位表达PD-1 的T 细胞，且PD-1 的摄取强度与活检肿瘤中表达PD-1 的T 细胞数量存在相关性[32]。Higashikawa等[33]研制了一种CTLA-4 靶向PET 分子探针（64Cu-DOTA-Anti-CTLA-4 mAb）来检测CTLA-4在CT26 荷瘤小鼠中的表达情况，发现CTLA-4 的高表达与T 细胞浸润肿瘤相关。Xiao 等[34]发现了一种诱导型T 细胞共刺激因子（inducible T-cell costimulator，简称ICOS 或CD278），并依此设计了一种ICOS 靶向分子探针（89Zr-DFO-ICOS mAb），使用PET 显像可将Lewis 肺癌模型中T细胞的激活可视化，并以此预测疗效。上述研究结果均表明靶向细胞表面标志物在T 细胞显像中的可行性与安全性。

3.2 基于新陈代谢途径的T 细胞显像

代谢途径可作为靶点来区分激活和未激活的T 细胞，脱氧胞苷激酶（dCK）和脱氧鸟苷激酶（dGK）是脱氧核糖核苷酸挽救途径中的限速酶，目前已有多种示踪剂被开发作为其底物。18F-氯法拉滨是一种通过脱氧胞苷激酶代谢的核苷酸嘌呤类似物，在造血骨髓和次级淋巴器官中的分布较广[35]，而另一种探针18F-脱氧阿糖鸟苷主要通过脱氧鸟苷激酶途径在激活的T 细胞中积聚[36]。

此外，T 细胞的激活还伴随着白介素2（interleukin-2，IL-2）的分泌及其受体的表达。D'Alessandria 等[37]将IL-2 与联肼尼克酰胺相连，使用99Tcm标记后用于活化T 细胞显像，用于检测慢性炎症反应和自身免疫性疾病。Hartimath 等[38]则用N-4-18F-氟代苯甲酰基标记IL-2（18F-FB-IL-2），用于监测因治疗引起的T 细胞激活状态，结果显示，在联合治疗和免疫治疗的肿瘤组织中，T 细胞浸润水平远高于仅接受放疗的肿瘤组织。

综上所述，内源性细胞显像可直接评估免疫治疗过程中体内特定细胞群（如细胞毒性T 淋巴细胞）的存在、定位、数量、激活和功能状态，并提供有关CAR-T 在治疗中作用的关键信息，对于CAR-T 疗法疗效的早期预测及改进具有重要的指导意义。

4 小结与展望

直接标记显像、报告基因显像和内源性细胞显像3 种方式均可通过PET 或SPECT 信号检测和定量观察CAR-T的移行、分布、存活等，且有助于确定正常组织中是否存在非特异性摄取，这对于评价脱靶毒性是关键的。直接标记在操作上最为简便，不足之处在于CAR-T 对射线较为灵敏，即使用放射性核素直接标记CAR-T，也可能会引起CAR-T 的死亡而致底物辐射泄露进而对其体内示踪产生干扰，虽可用纳米材料作为替代载体，但其潜在的毒性仍未可知。报告基因显像的不足之处在于潜在的安全性，如重组报告基因的慢病毒，感染CAR-T 时的随机插入等，且正常组织还可能存有报告基因的固有表达。内源细胞显像可以更有效地对T 细胞的激活和功能状态进行监测，可通过监测细胞的扩张或收缩来判断肿瘤负荷，从而间接反映无效的增殖（T 细胞继续增殖，但肿瘤没有得到控制）或有效的杀伤（T 细胞扩张后肿瘤缩小），有望解决和优化CAR-T疗法在实体瘤中所面临的挑战。

利益冲突所有作者均声明无利益冲突

作者贡献声明王培负责文献的查阅、综述的撰写；王帅亮负责观点的提出与综述的修订；朱华负责命题思路的指导；杨志负责综述的审阅