木霉与椰子水复配中量元素水溶肥促进黄瓜种子萌发和幼苗生长

徐宁 徐秋实 王剑宁 施雨桐 刘震 刘铜

摘 要：木霉菌在绿色农业病害防控中是一种重要的生防功能微生物，普遍开发为木霉菌剂用于生物防治、生物肥料及土壤改良剂。传统木霉菌剂的开发局限于木霉菌株的筛选及发酵条件的优化等，因此探索木霉菌新型应用方式具有重要的意义。椰子水在椰子工业生产中因其不耐储存、运输及开发成本高常作为废弃物直接排放丢弃。本研究以木霉孢子粉和热带废弃椰子水为材料，将废弃椰子水与木霉孢子粉复配成中量元素水溶肥，探究该水溶肥对黄瓜种子萌发与黄瓜幼苗生理指标的影响。结果表明：椰子水中添加中量元素并调整pH 7 对木霉产孢效果最好，产孢量达到2.32107 CFU/mL；木霉与椰子水复配中量元素水溶肥（A 处理）和椰子水与木霉复配水溶肥（B 处理）黄瓜种子萌发率分别为94.44%、87.50%，相对于无菌水（CK）提高了28.30%、18.87%，显著促进黄瓜种子的萌发。盆栽试验表明A 处理株高与根长分别为24.01、27.76 cm，较CK 分别提高48.03%、47.27%，显著促进黄瓜幼苗的生长；同时该处理组黄瓜幼苗茎鲜重与茎干重以及根鲜重与根干重也显著高于CK。进一步测定黄瓜幼苗的总叶绿素、还原糖与可溶性蛋白含量以及过氧化物酶（POD）与过氧化氢酶（CAT）活性，相较于CK 分别提高97.46%、66.32%、58.85%、32.67%、40.31%；并且能显著降低丙二醛（MDA）含量，较CK 降低79.96%。综上，木霉与椰子水复配中量元素水溶肥处理组可以显著促进黄瓜种子萌发和幼苗生长，提高了幼苗的总叶绿素、还原糖、可溶性蛋白含量以及POD 和CAT 活性，降低MDA 含量，增強黄瓜抵抗逆境胁迫的能力。

关键词：木霉；椰子水；水溶肥；黄瓜

中图分类号：S147.5 文献标识码：A

椰子水是椰子果实腔内的液体胚乳[1]，其主要成分有糖、维生素、生长促进因子、蛋白质和氨基酸等，具有较高的营养和保健价值[2-3]。然而在椰子产品的加工过程中因为椰子水不耐储存、运输及开发成本高等问题常作为废弃物直接倾倒、遗弃，无法有效将废弃椰子水大规模利用。

据统计，我国年加工椰子约25 亿个，每年废弃椰子水约6.25105～6.25106 t[4]。因椰子水中含有促生长因子，可将其加工制作成发酵基质以促进微生物的生长[5]。废弃椰子水中含有脂质、悬浮固体和挥发性脂肪酸，直接排放易造成环境微生物群落失衡、pH 变化，对环境安全有着极大的威胁。

因此合理开发利用椰子水，减少过度废弃对环境造成的污染是海南椰子产业发展亟待解决的问题。

木霉（Trichoderma spp.）是自然界广泛存在的生防功能微生物，具有促进植物生长、诱导并增强植物抗逆性等功能[6]。研究表明，使用木霉等有益微生物可能会促进作物的初级或次级代谢，提高作物产量[7-8]，改善作物品质[9]。研究报道木霉能与废弃物复配促进作物生长并提高产量。ARAUJO 等[10]发现污水污泥生物炭和哈茨木霉联合使用对大豆的产量具有增效作用。在木霉与水稻秸秆提取物中添加一定量的污泥水解物能够促进黄瓜和小白菜生长[11]。

氨基酸水溶肥具有能被植物快速吸收，增加作物产量和改善果实品质等优势，能有效减少农业生产中大量施用无机化肥和农药造成的环境污染[12]和农药残留等问题。随着人们生态环保意识的不断深化，氨基酸水溶肥的研究和应用越来越受到人们的重视[13]。目前木霉与椰子水复配成水溶肥的研究尚未见报道，单一施用木霉菌剂的效果并不理想，为了合理利用废弃椰子水，减少环境污染，同时挖掘木霉与氨基酸水溶肥复配的潜力，本研究将木霉与椰子水复配成中量元素水溶肥，探究木霉和废弃椰子水复配在农业生产中的应用，为推动绿色、高效的木霉水溶肥开发以及废弃椰子水的利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试作物为成都好特园艺有限公司川绿十一号黄瓜种子。供试菌株：Trichoderma asperellumFJ069（由海南省绿色农用生物制剂工程研究中心提供），已保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCCNo.17976。供试椰子水：海南工业废弃椰子由椰树集团提供。供试土壤：PINDSTRUP 草炭土。

供试 PDA 培养基[14]：200 g 马铃薯煮熟后滤液，葡萄糖20 g，琼脂15 g，ddH2O 定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 木霉孢子悬浮液制备将供试菌株T. asperellumFJ069 接种在PDA 培养基上，28 ℃光照培养5 d 后，刮取平板上的木霉孢子，用无菌水调整孢悬液浓度为1.0109 CFU/mL。

1.2.2 椰子水和中量元素对木霉产孢量的影响为探究椰子水和中量元素对木霉菌产孢能力的影响，试验共设置6 个处理组：（1）Y-Z（pH 7）：椰子水与中量元素复配并调整pH 7 ， 氯化钙58.275 g，硝酸镁55.5 g，椰子水定容至1 L；（2）Y-Z：椰子水与中量元素复配不调整pH，氯化钙58.275 g，硝酸镁55.5 g，椰子水定容至1 L；（3）Y（pH 7）：椰子水并调整pH 7；（4）Y：椰子水不调整pH；（5）Z：中量元素，氯化钙58.275 g，硝酸镁55.5 g，ddH2O 定容至1 L；（6）CK：无菌水。将上述处理组与1.0109 CFU/mL 木霉孢子悬浮液混合，摇匀后室温放置12 h，在无菌工作台均匀地涂布于PDA 固体培养基平板，每个处理组设置3 个重复，于28 ℃黑暗培养5 d 后，用1 mL无菌水冲洗刮取不同处理组的PDA 平板，在光学显微镜下利用血球计数板计算木霉孢子数量。

1.2.3 木霉与椰子水复配中量元素水溶肥对黄瓜发芽率的影响设置如下5 个供试各处理水溶肥配方。（1）处理A（木霉与椰子水复配中量元素）：T. asperellum FJ069 孢子含量1.0×109 CFU/mL，氯化钙58.275 g，硝酸镁55.5 g，椰子水（pH 7）定容至1 L；（2）处理B（椰子水与木霉复配）：T. asperellum FJ069 孢子含量1×109 CFU/mL，椰子水（pH 7）定容至1 L；（3）处理C（单施椰子水）：椰子水（pH 7）1 L；（4）处理D（单施木霉）：T. asperellum FJ069 孢子含量1×109 CFU/mL；（5）处理E（单施中量元素）：氯化钙58.275 g，硝酸镁55.5 g，ddH2O（pH 7）定容至1 L。

按照上述水溶肥配方设置 A、B、C、D、E处理，以无菌水为CK，共6 个处理组，探究各处理水溶肥对黄瓜发芽率的影响。预先用3%次氯酸钠将黄瓜种子消毒10 min，每个处理24 颗黄瓜种子，试验重复3 次。将黄瓜种子置于28 ℃条件下黑暗培养7 d 后调查黄瓜种子发芽率。

1.2.4 木霉与椰子水复配中量元素水溶肥对黄瓜幼苗生长生理指标测定将育苗基质草炭土于烘箱中181 ℃高温灭菌2 h，自然冷却后备用。将黄瓜种子用3%次氯酸钠消毒10 min，并催芽，催芽3 d 后將幼芽置于育苗盘中培养2 周，待黄瓜长出3 片真叶后选取长势一致的黄瓜幼苗移栽至育苗盆中培养7 d，再分别用A、B、C、D、E 五个处理，以无菌水为CK 灌根处理黄瓜幼苗，处理14 d 后调查黄瓜幼苗的茎长、根长、鲜重、干重以及黄瓜幼苗中总叶绿素含量、还原糖含量、可溶性蛋白含量、MDA 含量以及POD 和CAT 活性，其中可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法[15]，总叶绿素含量、还原糖含量、MDA 含量以及POD和CAT 活性均采用Solarbio 试剂盒测定。

1.3 数据处理

采用 Excel 2016 和IBM SPSS Statistics 25 软件进行数据统计分析，使用最小显著差异法（leastsignificant difference， LSD）检验进行多重比较；使用GraphPad Prism 9.3.1 软件作图。

2 结果与分析

2.1 椰子水与中量元素对木霉菌产孢量的影响

如图 1 所示，Y-Z（pH 7）和Y（pH 7）对木霉菌产孢效果较好，第5 天产孢量分别为2.32107、2.06107 CFU/mL，和其他处理组相比存在显著差异。其中Y（pH 7）处理与Y 处理存在极显著差异（图1）。上述结果表明木霉菌在pH 达到中性条件下的椰子水中的产孢效果最好。

2.2 木霉与椰子水复配中量元素对黄瓜萌发率的影响

如图 2 所示，试验结果表明A、B 处理萌发率分别为94.44%、87.50%，相较CK 分别提高28.30%、18.87%，显著促进黄瓜种子的萌发；A处理与C、D、E 处理组相比，存在极显著差异，萌发率显著提高，同时C、D、E 处理与CK 差异不显著，说明单施椰子水、木霉和中量元素对黄瓜种子的萌发效果并不理想；其中A、B 两处理差异不显著，说明在木霉与椰子水复配中量元素水溶肥中促进黄瓜种子萌发的主要因素在于木霉与椰子水的协同增效作用，可以显著提高黄瓜种子的萌发率，促进黄瓜种子萌发。

2.3 木霉与椰子水复配中量元素对黄瓜幼苗生理水平的影响

2.3.1 木霉与椰子水复配中量元素水溶肥对黄瓜幼苗生长的影响通过对黄瓜幼苗的株高调查发现（图3，表1），各处理组相较于CK 差异极显著，A、B、E 处理分别提高48.03%、40.51%、39.09%，A、B 两处理差异不显著； A 处理根长与其它处理组存在极显著差异，相较于B 处理提高21.97%，同时A、B、C、D 处理与CK 同样存在极显著差异，分别提高47.27%、20.74%、14.80%、12.20%，E 处理与CK 差异不显著。以上结果说明椰子水、木霉和中量元素单施或者复配均可以显著提高黄瓜幼苗株高，复配效果最好；木霉与椰子水复配中量元素水溶肥对黄瓜幼苗根系生长具有显著促进作用，中量元素对于黄瓜幼苗的作用效果主要集中于茎叶，对于根系无明显促进作用。

2.3.2 木霉与椰子水复配中量元素水溶肥对黄瓜幼苗鲜重与干重的影响如表 1 所示，各处理组相对于CK 茎鲜重存在极显著差异，A、B、C、D、E 处理分别提高52.61%、12.85%、17.67%、18.47%、19.00%，其中A 处理显著高于其它处理组，B、C、D、E 处理之间差异不显著；对黄瓜幼苗的根鲜重（表1）调查发现，各处理组较CK存在极显著差异，A、B 两处理分别较CK 提高35.87%、28.80%，D 处理与C、E 两处理差异不显著；由表1 茎干重结果可知，除C 处理外其余处理组相对于CK 存在极显著差异，其中A、B两处理之间无显著差异，分别较CK 分别提高32.39%、28.17%；据表1 根干重结果所示，A 处理较其它处理组差异极显著，高于B处理10.00%，相对CK 提高120.00%，C 处理与D、E 两处理差异不显著。以上结果表明，木霉与椰子水复配中量元素水溶肥能显著提高黄瓜幼苗茎、根鲜重与茎、根干重，椰子水、木霉和中量元素三者复配要显著好于单施效果，三者的协同增效作用可以显著促进黄瓜幼苗根茎生长，提高根茎生物量的积累。

2.3.3 木霉与椰子水复配中量元素水溶肥对黄瓜幼苗总叶绿素和还原糖含量的影响如图 4 所示，5 个处理组总叶绿素含量与CK 相比均有显著性提升，其中A 处理的效果最佳，达到33.43 mg/L，相较CK 提高97.46%，与其它处理组均存在极显著差异。B 处理显著高于C、D 处理组，分别增加34.66%、9.17%；由图4 可知，A、B、D、E处理组黄瓜幼苗还原糖含量与CK 相比均有显著提升，分别提高66.32%、46.84%、28.95%、24.74%，其中D、E 两处理差异不显著，同时C处理与CK 无显著差异。上述结果表明各处理对于总叶绿素和还原糖含量的影响趋势基本一致，其中以A 处理效果最好，说明木霉与椰子水复配中量元素水溶肥能显著促进黄瓜幼苗总叶绿素和还原糖的产生，另外C 处理总叶绿素含量在各处理相较于CK 中差异最小，在还原糖含量中无差异，表明在木霉、椰子水和中量元素三者中促进黄瓜幼苗总叶绿素和还原糖产生的主要因素在于木霉和中量元素的共同作用。

2.3.4 木霉与椰子水复配中量元素水溶肥对黄瓜幼苗可溶性蛋白和丙二醛含量的影响由图 5 可知，A、B、C、D 处理与CK 可溶性蛋白含量相比存在极显著差异，分别增加58.85%、24.73%、14.07%、14.50%，其中A 处理相较于其它处理对于提升可溶性蛋白含量的效果最为显著，B、C、D 处理之间差异不显著，说明木霉与椰子水复配中量元素水溶肥对于黄瓜幼苗产生可溶性蛋白的效果要好于三者单施以及椰子水与木霉复配；如图5 所示，各处理组相较CK 均能显著降低黄瓜幼苗丙二醛的产生，A、B、C、D、E 处理分别降低79.96%、68.22%、22.34%、68.63%、39.75%，C 处理降幅最小，说明椰子水相较木霉和中量元素对于减少黄瓜幼苗MDA 含量的影响效果最小，MDA 含量水平的高低可以作为考察黄瓜幼苗受到胁迫严重程度的指标之一，直接反映黄瓜叶片膜脂过氧化程度。在CK 中以无菌水处理的黄瓜幼苗正常生长的生理水平下，木霉、椰子水和中量元素不论单施还是复配均能减少MDA的产生，减弱膜脂过氧化程度，减少脂质过氧化对黄瓜幼苗的伤害。

2.3.5 木霉与椰子水复配中量元素水溶肥对黄瓜幼苗过氧化物酶与过氧化氢酶活性的影响如图6 所示，A、B、D、E 处理的过氧化物酶（POD）活性与CK 相比均显著提高，分别提高32.67%、25.85%、11.45%、17.25%，其中以A、B 处理的POD 活性最高，显著高于C、D、E 处理组。由图6 可知，各处理过氧化氢酶（CAT）活性相对CK 均存在极显著差异，分别增加40.31%、35.34%、12.52%、20.85%、18.16%，A 处理CAT活性为7 5 6.97 U/ g ， B 处理CAT 活性为730.13 U/g，均显著高于C、D、E 处理，但A、B处理之间差异并不显著。上述结果中各处理分别对黄瓜幼苗POD 和CAT 活性的影响接近一致，椰子水、木霉和中量元素三者复配相较于单施对于黄瓜幼苗抗氧化酶活性的提高均有显著影响，表明木霉与椰子水复配中量元素水溶肥有利于提高黄瓜幼苗POD 和CAT 活性，增强ROS 的清除能力。

3 讨论

木霉是目前应用最为广泛的生防真菌之一，能有效促进作物生长[16]。研究发现，木霉对玉米苗期的根系、株高、鲜重和干重等生长指标都有显著的提高作用[17]；还可以促进黄瓜种子萌发、幼苗生长和生物量积累[18]。椰子水中含有促生长因子等营养物质，可将其加工制作成发酵基质以促进微生物的生长[5]。有研究表明，利用废弃椰子水处理后可以显著提高木霉的孢子含量[19]；同时椰子水可以等效替代马铃薯葡萄糖培养基促进木霉菌丝生长[20]；VIJI 等[21]发现椰子水基质可以增加T. asperellum 的菌落数量。中量元素是植物生长过程中所必须的元素，在水溶肥中添加中量元素能够为作物补充钙、镁等营养元素，改善作物的品质，提高作物的产量。孟素梅等[22]发现中量元素水溶肥对水稻增产效果显著；何峰等[23]研究表明中量元素水溶肥能促进黄瓜果实膨大及增长，提高果实品质，增加产量。本研究结果表明，椰子水和中量元素复配并调整pH=7 时相较于CK对T. asperellum FJ069 的产孢效果提升显著，第5天产孢量达到2.32107 CFU/mL，另外Y-Z（pH 7）、Y（pH 7）处理的产孢量均高于未调整pH 的Y-Z、Y处理；与研究报道的结果一致，说明椰子水和中量元素复配能促进木霉产孢，并且在中性环境下效果更为显著。椰子水中含有丰富的氨基酸[3]，中量元素和中性环境的存在为木霉提供了产孢所需的充足条件，使木霉与椰子水复配中量元素成为可能。目前尚未有研究报道木霉与椰子水复配中量元素水溶肥对作物生长的影响，因此本研究以废弃椰子水再利用为出发点，探究椰子水与中量元素复配对木霉产孢的影响以及木霉与椰子水复配中量元素水溶肥对黄瓜种子萌发和幼苗生长的影响。

有研究表明，木霉與椰子水分别处理植物种子均能显著促进萌发，提高发芽率。谢琳淼等[24]研究发现哈茨木霉提取液对紫羊茅和草地早熟禾种子的发芽势、发芽率、发芽指数等都有显著提升。丁长春等[25]发现添加10%的椰子水会增加黄兜兰种子的萌发率。在培养基中添加椰子水可以提高凤兰种子的发芽速率[26]。本研究结果也发现木霉与椰子水复配中量元素水溶肥（A 处理）、椰子水与木霉复配水溶肥（B 处理）相较于CK 均显著提高黄瓜种子萌发率，分别提高28.30%、18.87%，其中A、B 两处理差异不显著，说明在木霉与椰子水复配中量元素水溶肥中促进黄瓜种子萌发的主要因素在于木霉与椰子水的协同增效作用。

生物水溶肥将传统水溶肥与微生物菌剂结合在一起，是目前以绿色农业发展为背景下的大势所趋，生物水溶肥相对于传统肥料的优点在于能节约水肥资源、减少环境污染、促生抗病等[27]。

研究报道，生物水溶肥能显著促进作物生长、提高作物产量并提升果实品质。刘纯安[28]研究表明冲施含木霉氨基酸生物水溶肥可以显著促进茄子植株生长，提高茄子产量并改善果实品质。LIU等[29]基于T. guizhouense NJAU4742 添加氨基酸水溶肥能显著促进辣椒生长；张常书等[30]用木霉生物腐植酸水溶性肥代替化肥用于瓜果蔬菜根施或冲施追肥，黄瓜产量较化肥提高23.5%～38.4%，草莓、西葫芦、西兰花产量提高10%～15%；严程明等[31]发现氨基酸水溶肥可以显著提高苗期玉米根系干物重、地上部干物重、株高和茎粗。卢云峰等[32]发现复合微生物液体肥料能显著提高玉米和白菜的产量。本研究结果符合以上研究报道，木霉与椰子水复配中量元素水溶肥（A 处理）相较于CK 显著促进黄瓜幼苗的生长，株高、根长提高48.03%、47.27%；E 处理（单施中量元素）株高相对于CK 促进效果显著，而对于根长无显著差异，表明中量元素对于黄瓜幼苗的作用效果主要集中于茎叶，对于根系无明显促进作用。A处理中茎鲜重、根鲜重、茎干重和根干重相较CK存在极显著差异，分别增加52.61%、35.87%、32.39%、120.00%，并且A 处理始终显著高于C、D、E 处理，结果表明木霉与椰子水复配中量元素水溶肥能显著提高黄瓜幼苗茎、根鲜重与茎、根干重，椰子水、木霉和中量元素三者复配要显著好于单施效果，三者的协同增效作用可以显著促进黄瓜幼苗根茎生长，提高根茎生物量的积累。

总叶绿素、还原糖、可溶性蛋白等都是反映植物生理状况的重要指标；丙二醛（MDA）是膜脂过氧化物的重要产物，其含量的变化可以反映植物细胞膜脂过氧化的水平及细胞损伤的程度[33]。过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）是植物体内重要的抗氧化酶，具有清除活性氧自由基、抵御和修复逆境损伤的作用，是植物体内一类重要的生理活性物质[34]。有研究报道表明，氨基酸生物水溶肥的冲施显著提高了茄子的还原糖、可溶性蛋白含量，改善了茄子的品质[28]；施用水溶肥能提高黑塌菜叶绿素、还原糖含量[35]；氨基多糖水溶肥明显提高小麦可溶性蛋白含量，提高POD 的活性，降低MDA 含量[34]；王玮等[33]发现适宜浓度的氨基多糖水溶肥可以增强萝卜叶片的抗氧化酶（POD、CAT）活性，降低MDA含量，提高萝卜肉质根中可溶性总糖、可溶性蛋白含量；曹焱[36]报道氨基酸水溶肥能降低草莓叶片MDA 含量，提高过氧化物酶和过氧化氢酶活性；李艳娟等[37]发现2 种不同浓度哈茨木霉与绿色木霉溶液不但可以促进杉木种子萌发及生长，还可以提升其抗氧化酶活性，降低MDA 含量。

以上研究表明，木霉和水溶肥都可以促进植物生长，优化生理指标，降低MDA 含量，提高抗氧化酶活性，这使得木霉与椰子水复配中量元素水溶肥成为了可能。本文研究结果与上述报道相一致，结果表明木霉与椰子水复配中量元素水溶肥相较CK 可以显著提高黄瓜幼苗总叶绿素、还原糖、可溶性蛋白含量以及POD 和CAT 活性并降低MDA 含量。

综上所述，木霉与椰子水复配中量元素水溶肥能显著提高黄瓜种子萌发，促进幼苗生长并提高黄瓜叶片总叶绿素、还原糖、可溶性蛋白含量以及POD 和CAT 活性，降低MDA 含量，增强黄瓜抵抗逆境胁迫的能力。

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