氮化钛镀层和镍镀层钕铁硼磁环的生物相容性实验研究

张苗苗，任宇翔，王伊睿，孙宛婧，白纪刚，吕 毅，严小鹏*

（1.西安交通大学第一附属医院肝胆外科，西安 710061；2.西安交通大学第一附属医院精准外科与再生医学国家地方联合工程研究中心，西安 710061；3.西安交通大学宗濂书院，西安 710061；4.西安交通大学启德书院，西安 710061）

0 引言

磁吻合是利用特殊设计的磁性装置，借助磁体间的磁场力来实现空腔脏器吻合重建的方法。由于磁吻合形式的特殊性而被称为继手工缝线吻合和机械钉式吻合之后的第三种吻合模式，又因磁吻合与内镜技术和介入技术相结合可实现常规方法无法实现的吻合，因此又被誉为“智慧吻合”[1]。消化道是磁吻合基础研究和临床应用最广泛的领域，相关研究涉及食管磁吻合[2-4]、食管胃磁吻合[5]、胃空肠磁吻合[6-7]、小肠磁吻合[8-9]、结肠磁吻合[10-11]等。磁吻合装置也可用于泌尿系统如输尿管膀胱吻合[12]，还可用于气管食管瘘病理动物模型的建立[13-14]以及治疗性造瘘[15-16]等领域。

利用磁吻合装置实现消化系统和泌尿系统管腔吻合重建时，受压组织发生缺血—坏死—脱落，而受压旁组织则发生粘连—修复—愈合的病理变化过程[17]，在吻合口建立后磁吻合装置可经消化系统或泌尿系统的自然腔道排出体外[18-21]。当利用磁吻合装置进行血管吻合时，不管是端端吻合还是侧侧吻合，磁吻合装置可能需要永久留置体内，因此血管磁吻合对吻合装置的生物相容性提出了更高的要求。血管端端吻合时，磁环位于血管外，不与血液接触，因此做好磁体的防腐蚀即可满足应用需求。血管侧侧吻合时，磁环位于血管内，与血液直接接触，因此磁环需要有良好的血液相容性。

电镀镍是目前钕铁硼材料最常见的表面改性方法，能够满足工业和日常生活环境下的防腐蚀需求，但在胃液环境下抗腐蚀能力较差[22]。有研究显示，氮化钛镀层后的钕铁硼磁体抗体液腐蚀能力优于镍镀层[23]。但有关氮化钛镀层和镍镀层钕铁硼磁体生物相容性的评价较少，尤其是当其应用场景为血管侧侧吻合时。因此，本文通过体内外实验对课题组自行设计的用于血管侧侧吻合的氮化钛镀层和镍镀层的2 种钕铁硼磁环的生物相容性进行测试和评价。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用仪器有超声清洗仪（SB5200DT，宁波新芝生物科技股份有限公司）、视频光学接触角测量仪（OCA-20，德国Dataphsics 公司）、酶标仪（Multiskan Skyhigh，美国Thermo Fisher Scientific 公司）、扫描电镜（KYKY-2000，日本HITCH 公司）；试剂有戊巴比妥钠（美国Sigma）、无菌生理盐水（陕西华山制药厂）、无菌双蒸水（实验室自制）、稀释的抗凝健康人全血（新鲜人血∶生理盐水=4∶5）、富血小板血浆（PRP）（健康人全血提取而成）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（上海研拓生物科技有限公司）、2.5%戊二醛（上海源叶生物科技有限公司）、1%锇酸（上海雅吉生物公司）、100%乙酸异戊酯（上海百舜生物科技有限公司）。

本实验所用磁环由N45 烧结型钕铁硼永磁材料加工而成，其中氮化钛镀层磁环为跑道型，长16 mm、宽9 mm，宽度和厚度均为1 mm，单个磁环质量为0.215 g；镍镀层磁环为椭圆形，长轴10 mm、短轴4 mm，宽度和厚度均为1mm，单个磁环质量为0.186 g。上述磁环由陕西金山电器有限公司加工，实物图如图1 所示。

图1 磁环实物图

1.2 实验方法

1.2.1 接触角测试

各取3 枚氮化钛镀层和镍镀层磁环经超声清洗仪清洗后利用OCA-20 视频光学接触角测量仪测量接触角。测量时先设置电荷耦合器（charge couple device，CCD）的亮度，并调节载物套和针头使之处于合适的位置。然后调节镜头进行对焦并设定标尺，进一步调节基线的位置。设定液体体积为0.5 L 后开始进行试验，待液滴滴落后再一次调节基线和液滴轮廓线，然后即可画出接触角。

1.2.2 组织相容性测试

该实验经西安交通大学生物医学伦理委员会审批通过。选取SD 大鼠12 只（购于西安交通大学实验动物中心），体质量为180～220 g，雌雄各半，并随机分为2 组，每组6 只。一组置入氮化钛镀层磁环作为实验组，另一组置入镍镀层磁环作为对照组，另以正常大鼠作为空白对照，仅仅获取正常的肌肉组织和大网膜组织。实验方法如下[24]：氮化钛镀层和镍镀层磁环经超声清洗仪清洗后用环氧乙烷灭菌备用。所有大鼠采用3%戊巴比妥钠（0.1 mL/100 g）腹腔注射麻醉，麻醉生效后仰卧位固定，用剃毛器剃除右后肢股部及腹部体毛，并于术区消毒铺无菌巾。用组织剪剪开大鼠右后肢股内侧皮肤，长约10 mm，避开大血管及神经，钝性分离肌肉将磁环埋于肌肉组织间，之后缝合皮肤。取大鼠腹部正中切口，长约10 mm，将磁环置入大网膜处，关闭腹腔。术后3 个月，再次麻醉大鼠，探查磁环包埋部位的组织粘连情况并获取磁环周围肌肉组织和大网膜行HE 及Masson 染色。以大鼠正常肌肉组织及大网膜病理切片为对照，观察炎性细胞浸润及胶原纤维沉积情况。

1.2.3 溶血实验

溶血实验参照刘敬肖等[25]的实验方法。取6 支无菌试管分别装入预先用环氧乙烷灭菌处理的氮化钛镀层磁环和镍镀层磁环作为实验组和对照组，每支试管内加入10 mL 无菌生理盐水，氮化钛镀层磁环编号为A 组，镍镀层磁环编号为B 组。另取6 支试管，其中3 支内加入10 mL 无菌生理盐水作为阴性对照组（C 组）；剩余3 支试管内加入10 mL 无菌双蒸水作为阳性对照组（D 组）。将上述试管置入37 ℃恒温水浴箱内预热30 min，在每支试管内加入0.2 mL稀释的抗凝健康人全血（新鲜人血∶生理盐水=4∶5），继续置于37 ℃恒温水浴箱内。60 min 后取出试管，然后以3000 r/min 离心5 min。对每支试管取离心后的上清液3 份，每份100 μL，加入到96 孔培养板中，用酶标仪测量每份样本在540 nm 处的吸光度。根据以下公式计算溶血率：

式中，Dt为待测样品吸光度；Dnc为阴性对照组吸光度；Dpc为阳性对照组吸光度。

1.2.4 血小板黏附实验

血小板黏附实验参照吴勃等[26]文献中介绍的实验方案：（1）在12 孔培养板中分别放置预处理过的氮化钛镀层磁环和镍镀层磁环，缓慢加入3 mL 事先制备的PRP，PRP 的制备参照文献[27]的方法，然后放入CO2培养箱中分别培养0.5 h 和3 h；（2）预定培养时间结束后，去除PRP 后用PBS 反复缓慢漂洗3次，每次1 min，弃去漂洗液，加入2.5%戊二醛使磁环完全被浸泡，然后在4 ℃冰箱中固定12 h；（3）弃去戊二醛固定液，用PBS 漂洗后加入1%锇酸使磁环完全被浸泡，然后置于4 ℃冰箱中固定1 h；（4）弃去锇酸，加入蒸馏水进行漂洗，然后依次加入体积百分比为50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液进行梯度脱水10 min；（5）用100%乙酸异戊酯浸泡样品10 min，之后用临界点干燥仪进行干燥；（6）对经上述处理后的样品进行喷金，用扫描电镜观察样品表面的血小板黏附数量和聚集状态。

2 结果

2.1 接触角测试

测试结果显示，3 枚氮化钛镀层磁环接触角分别为98°、99°、100°，3 枚镍镀层磁环接触角分别为100°、101°、106°，均＞90°，提示磁环表面为疏水性，说明液体不易在其表面浸润吸附。

2.2 组织相容性测试

磁环置入过程顺利，所有大鼠均存活至观察终点。磁环周围肌肉组织及大网膜的HE 及Masson 染色可见肌肉组织形态结构正常，以正常肌肉组织及大网膜组织病理为参照，未见明显的炎性细胞浸润和组织异物反应（如图2、3 所示）。

图2 磁环留置后肌肉组织学观察结果

图3 磁环留置后大网膜组织学观察结果

2.3 溶血实验

各组吸光度测试结果见表1。根据公式计算氮化钛镀层磁环的溶血率为0.23%，镍镀层磁环的溶血率为0.84%。可见氮化钛镀层磁环的溶血性能优于镍镀层磁环。

表1 各组上清液在540 nm 处的吸光度测试结果

2.4 血小板黏附实验

2 种磁环分别与PRP 共培养0.5 h 后，扫描电镜显示氮化钛镀层磁环表面未见明显血小板黏附，而镍镀层磁环表面可见少量血小板黏附（如图4 所示）；当磁环与PRP 共培养3 h 后，氮化钛镀层磁环表面有散在血小板黏附，并且可见伪足生长，镍镀层磁环表面黏附的血小板数量明显增多并呈聚集性黏附，伪足生长明显（如图5 所示）。

图4 磁环与PRP 共培养0.5 h 后扫描电镜观察结果

图5 磁环与PRP 共培养3 h 后扫描电镜观察结果

3 讨论

血管磁吻合包括血管端端磁吻合和血管侧侧磁吻合。与血管端端磁吻合不同，血管侧侧磁吻合时磁环位于血管腔内，与血液直接接触，因此对磁环的生物相容性要求极高。既往有研究报道利用钕铁硼磁环进行冠状动脉搭桥手术，术后磁环留置在人体内，该磁环使用氮化钛镀层，在患者服用抗凝药的情况下吻合口可获得良好的长期通畅性[28]，但也有个别患者因停用抗凝药而导致吻合口闭塞的发生[29]。本研究团队前期首次提出血管侧侧吻合用于门静脉高压的限制性分流，并设计了用于血管侧侧吻合的磁环[30]。在本团队前期研究过程中发现，磁吻合门腔分流术后，与血液接触的磁环表面将形成一层薄的血管内膜覆盖整个磁环[31]，这样的病理变化提示，磁环早期需要具备较高的血液相容性，避免短期内形成大量附壁血栓，为血管内膜的覆盖创造条件。

钕铁硼磁体表面改性方案多样，在具体应用时根据不同的环境可选择最适宜的表面改性方案。血管磁吻合装置的磁体表面改性方法研究较少，尚无公认的最优化表面改性方案，这是导致血管磁吻合装置临床转化应用较慢的重要原因之一。因此对不同表面改性方案的钕铁硼磁环的生物相容性进行比较，对血管磁吻合装置的设计、加工具有重要的参考价值。

生物相容性评价包括组织相容性和血液相容性2 个方面。磁外科技术中磁体的体内留置分为暂时留置、短期留置、中-长期留置、长期-永久留置等类型[32]，根据留置部位可分为器官组织内留置如磁性水凝胶辅助内镜黏膜下剥离术[33-34]、器官腔隙内留置如磁锚定辅助腹腔镜手术[35-36]，不同留置类型和留置部位下对磁体的表面改性要求差异巨大。本研究中磁环的留置属于器官腔隙内的永久留置。本研究通过SD 大鼠肌肉和大网膜包埋评价了氮化钛镀层和镍镀层磁环的组织相容性，大体标本及组织学观察未见明显组织粘连、异物肉芽肿形成及炎性细胞浸润。溶血实验显示氮化钛镀层磁环优于镍镀层磁环。血小板黏附实验结果也表明磁环与PRP 共培养0.5 h和3 h 后，氮化钛镀层磁环的血小板黏附少于镍镀层磁环。本文从接触角、组织相容性、溶血率及体外血小板黏附等多维度评价了氮化钛镀层与镍镀层钕铁硼磁环的生物相容性，但缺乏在体的血液相容性评价，下一步研究中可考虑将磁环置入大动物血管内评价其血栓形成情况。

综上所述，氮化钛镀层钕铁硼磁环与镍镀层钕铁硼磁环相比在接触角、组织相容性指标上相近，但在溶血率和血小板黏附指标方面，氮化钛镀层磁环明显优于镍镀层磁环，这提示磁外科体内置入装置应将氮化钛镀层作为优先考虑的表面改性方案。