真空浓缩对河蟹酶解液蟹味挥发性风味物质的影响

符慧靖，李 彦，沈德熊，丁 莉，吴子健，马俪珍,

（1.天津农学院食品科学与工程学院，天津 300392；2.可可溢香（江苏）味业有限公司，江苏兴化 225700；3.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134）

河蟹，学名为“中华绒螯蟹”，又称“大闸蟹”，是中国重要的经济类淡水养殖产品之一[1]。近年来兴化及周边地区大闸蟹产销量已达到20 万吨。兴化大闸蟹除了具有江苏蟹“壳青、肚白、金爪、黄毛”的共性特点外，脂膏丰满纯正、肉质玉白爽嫩、蟹黄晶红油润、入口鲜香溢甜是兴化大闸蟹典型内在特征。但这样优质的河蟹只能以最初级的“鲜活”方式贩售，而且受养殖季节的限制，蟹多价贱，无法体现应有的高附加值，严重制约了养蟹业的发展[2]，特别是对于约占河蟹产量40%的50～100 g 重的小螃蟹、残蟹、“老头蟹”等，有效利用率更低[3]。然而，这些低值产物中不仅含有丰富的蛋白质，还富含虾青素、甲壳素和钙[4]。将这些低值蟹经过蛋白酶作用形成富含鲜味氨基酸的酶解液，可用于制备水产调味（基料）品[5]。随着科学技术的进步，新型天然海鲜调味品已成为当前水产品开发热点。陈启航等[6]以金枪鱼蒸煮液为原料，经过酶解调配得到了金枪鱼调味汁；耿瑞婷[7]以扇贝加工副产物为原料，经酶解工艺制得了高品质的海鲜调味汁；刘素磊[8]以南美白对虾虾头为原料，经酶解调配研制出一种虾味浓郁、营养丰富的虾调味汁。

本试验前期以残肢、断肢河蟹为原料，经高压浸提、风味蛋白酶酶解，得到一种蟹味浓郁的河蟹酶解液。蟹味是人们非常喜欢的一种风味，是由其风味前体物质在加热或酶催化的作用下转化而来。形成蟹味的挥发性风味物质种类较多，主要包括各种醛类、酮类、醇类、烃类、酯类、呋喃类等[9]。在后续研究中发现，将蟹味浓郁的酶解液再进行热处理时，因为受热作用而使蟹味发生挥发，导致热加工后的产品蟹味明显降低。这一现象对于后续酶解液的进一步加工会带来不利影响。真空浓缩可以很好地保留原料的营养成分和香气，是一种很好的加工手段[10-13]。因此，本试验采用电子鼻、顶空-固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS）探究真空浓缩对河蟹酶解液蟹味挥发的影响，为后续河蟹酶解液加工利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

低值河蟹 可可溢香（江苏）味业有限公司；风味蛋白酶（36000 U/g） 天津诺奥酶生产力促进有限公司；小苏打 上海枫未实业有限公司；冰乙酸 广州康本生物科技有限公司。

SX-500 高压蒸汽灭菌锅 日本TOMY 有限公司；Agilent7890A/5975C 气相质谱仪 美国Agilent公司；HERACLESII 快速电子气味分析仪 法国ALpha Mos 公司；65 μm PDMS/DVB 萃取头 美国Supelco 公司；20 mL 顶空进样瓶 多文医疗器材有限公司；微量进样针10 mL 瑞士Hamilton 公司；DLK-5003 旋转蒸发仪 宁波新芝生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 河蟹高压浸提液（High pressure extract of river crab，HPEC）的制备 根据本实验室前期研究方法制备：将清洗后的河蟹放入沸水中烫漂3 min 至外壳变红，取出沥干水分后用绞肉机绞成蟹泥，将蟹泥与水按质量比1:4 装入锥形瓶中，121 ℃下高压浸提2 h后得到HPEC。

1.2.2 河蟹酶解液（River crab enzymolysis liquid，RCEL）的制备 根据本实验室前期研究方法制备：将上述得到的HPEC，调节pH 至7.0，加入0.25%（质量浓度）的风味蛋白酶，搅拌均匀后在50 ℃温度条件下酶解2 h，沸水浴灭酶10 min，过滤得到RCEL。

1.2.3 真空浓缩单因素实验设计 影响RCEL 真空浓缩后蟹味挥发程度的因素主要考查真空浓缩温度和真空浓缩体积，真空度为0.125 MPa。

1.2.3.1 真空浓缩温度对RCEL 蟹味挥发程度的影响 取1.2.2 制备的RCEL（每组100 mL）放入真空浓缩瓶中，按试验设计选择温度，固定转速为60 r/min，固定真空浓缩体积（样品浓缩至原体积的1/2）时，停止旋转蒸发过程，得到酶解液浓缩液（Concentration of the enzymatic solution，CES），同时收集蒸馏出的水分（Evaporated water，EW）。试验过程中设置真空浓缩的温度分别为20、30、40、50、60、70 ℃，这样就可以得到6 组CES 和6 组EW，分别记为20CES、30CES、40CES、50CES、60CES、70CES；20EW、30EW、40EW、50EW、60EW、70EW。将所得到的12 份样品（6 组CES 和6 组EW）和RCEL 进行电子鼻PCA 分析。

根据电子鼻（PCA）分析结果，试验取HPEC、RCEL、50CES、50EW 样品，采用顶空-固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS）进一步定性定量分析，以探究RCEL 的主要挥发性风味物质。

1.2.3.2 真空浓缩体积对RCEL 蟹味挥发程度的影响 取1.2.2 制备的RCEL（每组100 mL）放入真空浓缩瓶中，固定转速为60 r/min，真空浓缩温度为50 ℃，当真空浓缩体积分别浓缩至原体积的3/4、1/2、1/4 时，停止旋转蒸发过程，得到CES，同时收集EW，分别记为3/4CES、1/2CES、1/4CES；3/4EW、1/2EW、1/4EW。最后将3/4CES、1/2CES、1/4CES；3/4EW、1/2EW、1/4EW 以及RCEL 进行电子鼻PCA分析。

1.2.4 指标测定方法1.2.4.1 HeraclesII 超快速气相电子鼻分析 取5 mL样品于20 mL 顶空样品瓶中，将样品放置于50 ℃水浴锅中水浴24 min，用10 mL 进样针吸取顶空瓶中5 mL 气体，手动进样，注射入HERACLESII 快速电子气味分析仪进样口中。试验参数：进样口温度200 ℃，持续进样时间10 s，捕集阱温度40 ℃，捕集井分流速率10 mL/min，阀温度250 ℃，柱温的程序升温方式0.5 ℃/min 升到100 ℃，1 ℃/min，100～200 ℃，采集时间140 s。

1.2.4.2 香气感官评定 随机选择10 名经过感官评定培训的人员，对制备的HPEC、RCEL、50CES 和50EW 蟹味强弱进行评定，蟹味浓，取7～10 分；蟹味稍浓，取4～7 分；蟹味较淡，取0～4 分。

1.2.4.3 挥发性风味物质的检测 分别取待测样品于20 mL 的顶空瓶中，加入5 mL 饱和NaCl 溶液和1 μL 的2-甲基-3-庚酮（0.08 μg/μL），将老化的萃取头插入样品瓶，恒温60 ℃吸附45 min 后拔出，萃取头在GC 进样口（240 ℃）下解吸附4 min。

GC 条件：DB-WAX 毛细管色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；载气（He）流速：1 mL/min，不分流进样；起始温度45 ℃，2 min，后以6 ℃/min 速率升到230 ℃，保持5 min；运行时间：38 min。

MS 条件：离子源温度230 ℃，界面温度250 ℃，MS 四极杆温度150 ℃，溶剂延迟3 min，质量扫描范围m/z 30～500。

风味化合物相对于2-甲基-3-庚酮的含量，计算公式如下：

式中，C：测定挥发性化合物浓度，μg/L；AX：测定挥发性化合物的峰面积，AU·min；C0：内标物的浓度，0.08 μg/μL；A0：内标物的峰面积，AU·min；V：内标物的进样量，μL；v：测定样品的体积，mL。

1.3 数据处理

采用电子鼻自带的软件系统进行PCA 分析，采用Excel 软件进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 不同真空浓缩温度下RCEL 蟹味挥发程度的电子鼻主成分分析

真空浓缩温度对RCEL 蟹味挥发程度的电子鼻PCA 分析结果如图1 所示，图1A 和图1B 分别代表在不同真空浓缩温度下浓缩得到的各组酶解液（CES）和蒸馏出来的水分（EW）的PCA 分析。由图1可知，图1A 和图1B 的第一主成分的方差贡献率分别为88.535%和99.967%，第二主成分的方差贡献率分别为5.041%和0.021%，两者累计的总贡献率为93.576%和99.988%，表明该图谱能够真实地反映出所测样品中气味数据的完整性。在PCA 图谱中，样品之间的相对距离越近，说明样品的整体气味越接近，反之差异则越大。从图1 可以看出，在不同真空浓缩温度下浓缩得到的酶解液（CES）和蒸馏出来的水分（EW）与河蟹酶解液原液（RCEL）之间的相对距离均较远，说明RCEL 只要经过真空浓缩，无论真空浓缩的温度如何变化，其风味均发生了显著变化。由图1A 可知，随着真空浓缩温度的升高，各组之间距离发生不同程度的变化，除20CES 之外，30CES、40CES、50CES、60CES 和70CES 在第一主成分上的相对距离非常近。从第二主成分上看20CES、30CES、40CES 之间距离较大，而50CES、60CES、70CES 之间的距离较近，且在同一象限中。第一主成分的贡献率远大于第二主成分，说明样品在横坐标上距离越大，差异性也越大。由图1B 可知，EW 整体上与RCEL 和HPEC 之间相对距离较远，但除20EW 之外，30EW、40EW、50EW、60EW 和70EW 基本都重叠在一起，这说明不管真空浓缩温度如何变化，蒸馏出来的水中（EW）的风味基本一致，与RCEL 和HPEC 的风味完全不同。由此可以看出，结合第一主成分和第二主成分的分析结果，除20 ℃外，其它6 个温度下的真空浓缩样品在第一主成分的PCA 几乎重叠在一起，而在第二主成分上则是50CES、60CES、70CES、50EW、60EW、70EW样品也重叠在一起，但它们均与RCEL 和HPEC 距离较远。可见不同真空浓缩的温度下各样品的变化是一致的。所以，根据实际生产中常应用的真空浓缩温度，选择50 ℃下真空浓缩的50CES 和50EW 样品与RCEL 和HPEC 样品进行HS-SPME-GC-MS分析，以了解发生变化，如丢失使得蟹味强度降低的挥发性风味物质。

图1 不同真空浓缩温度下RCEL 蟹味挥发程度的电子鼻PCA 分析图Fig.1 Electronic nose PCA analysis chart of volatilization degree of RCEL crab flavor at different vacuum concentration temperatures

2.2 不同真空浓缩体积下RCEL 蟹味挥发程度的电子鼻主成分分析

真空浓缩不同体积下RCEL 蟹味挥发程度的电子鼻PCA 分析结果如图2 所示，图2A 和图2B 分别代表在不同真空浓缩体积下浓缩得到的各组酶解液（CES）和蒸馏出来的水分（EW）的PCA 分析。由图2可知，图2A 和图2B 的第一主成分的方差贡献率分别为91.643%和65.667%，第二主成分的方差贡献率分别为4.488%和20.058%，两者累计的总贡献率为96.131%和85.725%。从图2 可以看出，在不同真空浓缩体积下浓缩得到的酶解液（CES）和蒸馏出来的水分（EW）与河蟹酶解液原液（RCEL）之间的相对距离均较远，但3/4CES、2/4CES、1/4CES 之间距离很近，3/4EW、2/4EW、1/4EW 之间的距离也很近，且基本处于同一象限中，说明虽然随着真空浓缩体积的变化，RCEL 的蟹味也发生了变化，但与真空浓缩体积之间关系并不密切。由图2A 和图2B 可知，3/4CES、2/4CES、1/4CES 之间和3/4EW、1/2EW、1/4EW 之间从第一主成分和第二主成分上分析得出，三者的位置基本一致，这也说明虽然RCEL 的蟹味发生了变化，但主要是与真空浓缩温度有关，与真空浓缩体积之间的关系并不密切。

图2 不同真空浓缩体积下RCEL 蟹味挥发程度的电子鼻PCA 分析图Fig.2 Electronic nose PCA analysis chart of volatilization degree of RCEL crab flavor under different vacuum concentration volumes

2.3 香气感官评定

图3 为HPEC、RCEL、50CES 及50EW 四组样品蟹味强弱的感官评定，由图3 可知，RCEL 的蟹味最强，这是由于风味蛋白酶的酶解作用，产生了更多的挥发性风味物质，使得RCEL 的蟹味更加浓郁；HPEC 和50CES 两者的蟹味强弱基本一致；50EW的蟹味最弱，可能是因为RCEL 在真空浓缩50 ℃条件下，虽然失去部分挥发性风味物质，但是并未被蒸发出的水分吸收。

图3 HPEC、RCEL、50CES 及50EW 蟹味强弱感官评定Fig.3 HPEC, RCEL, 50CES and 50EW crab taste strong and weak sensory evaluation

2.4 HPEC、RCEL、50CES、50EW 样品挥发性风味物质GC-MS 分析

由图1 的试验说明RCEL 经过真空浓缩，其风味会发生显著的变化，为进一步了解具体挥发性风味物质的变化情况，试验分析了HPEC、RCEL、50CES、50EW 样品挥发性风味物质的GC-MS 变化，结果见表1 所示。由表1 可以看出，共有8 大类36 种挥发性风味物质被检测出，主要有醛类5 种、醇类2 种、酯类4 种、酮类5 种、烃类6 种、酚类2 种、醚类1 种、杂环类（包括喹啉、吡嗪、吲哚）11 种。HPEC、RCEL、50CES、50EW 样品中的挥发性风味物质含量大小关系依次为RCEL＞50CES＞HPEC＞50EW，其值分别为13.9753、8.3862、6.2235、1.0855 μg/L，由此说明，河蟹高压浸提液（HPEC）蟹味并不浓郁，但经酶解后产生了更多的挥发性风味物质[5]，使河蟹酶解液（RCEL）具有浓郁的蟹味，但RCEL 在真空浓缩温度为50 ℃的条件下浓缩至其体积的一半时，其挥发性风味物质有明显的减少，即使在真空浓缩条件下对RCEL 中蟹味的挥发也会造成很大程度的影响。

表1 HPEC、RCEL、50CES、50EW 样品挥发性风味物质的含量Table 1 Contents of volatile flavor substances in HPEC, RCEL, 50CES and 50EW samples

2.4.1 醛类化合物分析 醛类一般由脂肪酸降解、氧化和氨基酸Strecker 反应产生的[14-15]，其气味阈值相对较低，可以提供花香和油脂香，对河蟹的风味形成有重要作用[16]，可以为河蟹增加鲜香。例如，苯甲醛是由氨基酸的斯特勒克反应生成的，与氨基酸的降解有关[17]，提供令人愉快的香气，是河蟹中的一种重要风味物质[18]，从表1 中可以看到HPEC 和RCEL中都含有苯甲醛，且HPEC 中苯甲醛含量最高为3.0143 μg/L，这可能是因为HPEC 经过121 ℃的高温高压处理。但经过真空浓缩处理后，苯甲醛含量降低为零。壬醛通常会产生一些令人不愉快、辛辣的刺激性气味[19]，壬醛仅在HPEC 中存在且含量较低（0.0573 μg/L）。在RCEL 种共检测到4 种醛类物质，除苯甲醛外，还有大茴香醛、3-乙基苯甲醛和2,4,5-三甲基苯甲醛，这3 种醛类物质均未在HPEC、50CES 和50EW 中检出。由此可以推断，构成RCEL 蟹味组成的重要醛类成分也许与苯甲醛、大茴香醛、3-乙基苯甲醛和2,4,5-三甲基苯甲醛及其比例组成有关。

2.4.2 醇类化合物分析 醇类大多来源于脂肪的氧化和羰基化合物的还原[20]，一般醇类化合物的阈值较高，所以对食品的风味贡献较小[21]，除非以高浓度或不饱和形式存在[22]。此次共检测出2 种醇类，分别为2-乙基己醇和1,3-辛二醇。其中2-乙基己醇在HPEC、RCEL、50CES 和50EW 中均检测到，其含量则是RCEL＞50CES＞HPEC＞50EW，2-乙基己醇在RCEL 中含量最高（2.0247 μg/L），经过真空浓缩后，50CES 含量几乎降低一半（1.1034 μg/L），且50EW 中含有0.2931 μg/L。这说明河蟹高压浸提液（HPEC）经过蛋白酶作用后得到河蟹酶解液（RCEL），代表其蟹味的醇类物质主要含有2-乙基己醇和少量的1,3-辛二醇（0.0988 μg/L），而2-乙基己醇物质容易挥发，50 ℃条件下真空浓缩会丢失一半的量。

2.4.3 酯类化合物分析 酯类被认为是发酵或脂质代谢生成的羧酸和醇的酯化作用的产物[23]，可以赋予食品一种香甜的果香味[24]，癸酸乙酯呈葡萄味[25]。在HPEC 中共检测到了2 种酯类，分别为环己基异硫氰酸脂和癸酸乙酯。RCEL 中只检测到1 种独有的酯类（N-苯甲酰基甘氨酸甲酯），且在HPEC、50CES 和50EW 中均未检测到，这可能是由于加入风味蛋白酶酶解作用产生的，可以赋予河蟹酶解液特殊的风味，但经过50 ℃的真空浓缩使其挥发，由此可以推断，N-苯甲酰基甘氨酸甲酯有可能是构成河蟹酶解液的浓郁蟹味的重要成分之一。

2.4.4 酮类化合物分析 酮类一般是由不饱和脂肪酸的氧化或氨基酸分解产生的[26]，酮类贡献于蟹等甲壳类水产品甜的花香和果香风味，并且有较低的阈值。C3～C17 的甲基酮类是碳链烃β-氧化及脱羧基作用后生成的，具有独特的果香和清香，并且花香味也随着碳链的延长而逐渐增强[16]。表1 中RCEL、50CES、50EW 中都检测到了2,5-二甲基-3-己酮，并且经过真空浓缩后50CES 样品中2,5-二甲基-3-己酮的含量比RCEL 有所提高（0.7654→2.1333 μg/L），说明这类物质不容易挥发，因为浓缩的原因导致其含量有所提高。RCEL 中除了检测到2,5-二甲基-3-己酮之外，还检测到异丁酰基丙酮和苯亚甲基苯乙酮2 种酮类化合物，并且这2 种酮类化合物在HPEC、50CES 和50EW 中均未检测到，试验说明，这两类物质非常容易挥发，所以推测异丁酰基丙酮和苯亚甲基苯乙酮有可能对构成RCEL 的蟹味有重要作用。

2.4.5 烃类化合物 烃类化合物可能是通过烷基自由基的脂质自氧化过程[27]或类胡萝卜素分解生成的，通常具有较高的芳香阈值，因此烷烃类对食品整体的香气贡献很小[28]。但一些支链烷烃，例如2,4,10,14-四甲基-十五烷在报道赋予小龙虾及加工废弃物一种清香甜香[29]。表1 的RCEL 中检测到2,2-二甲基十四烷、十一烷、9-辛基-二十烷和正二十烷，含量分别为2.4444、0.2469、1.1111 和1.1852 μg/L，而在50CES 和50EW 均未检测出。吉思茹[30]的报道中发现十一烷对蒸制中华绒螯蟹性腺的香气有重要的贡献作用。在RCEL 中所检测出的烃类化合物相对质量浓度占整体挥发性风味物质的相对质量浓度较高（45.2827%）。由此可以推断，这几种烃类物质有可能对河蟹酶解液的蟹味贡献较大。

2.4.6 酚类化合物 简单的酚生成一般是通过2 种途径，即木质素热降解和酚羧酸脱羧作用，所以酚类提供的是木香、焦香和烟熏香气[31]。此次共检测到2 种酚类化合物，HPEC 中未检测到酚类化合物。在RCEL 中检测到的2-烯丙基-4-甲基苯酚和2,5-二叔丁基对苯二酚，含量分别为0.1975 和0.1235 μg/L，其中2,5-二叔丁基对苯二酚成分，50CES 的含量有所提高（0.1235→0.9195 μg/L），50EW 中仍能少量检出（0.0326 μg/L）。由此试验说明，2-烯丙基-4-甲基苯酚与2,5-二叔丁基对苯二酚成分比较，前者容易挥发，而后者挥发性较弱。

2.4.7 醚类化合物分析 醚是醇或酚的羟基中的氢被烃基取代的产物，醚类化合物本身具有特殊的风味[32]。在此次检测中，只在RCEL 中检测到了4-烯丙基苯甲醚，含量为2.1975 μg/L，占整体挥发性风味物质含量的15.7242%，这可能是RCEL 与HPEC、50CES 及50EW 具有风味差异的原因之一。

2.4.8 杂环类化合物分析 主要检测到的杂环类化合物为吡嗪、吲哚和喹啉。杂环类化合物是美拉德反应产物，在食品中通常对蒸煮和烧烤等风味有贡献[33]。其中吡嗪类化合物是美拉德反应和热解反应产物，通过斯特勒克反应生成，一般具有烤香和坚果香，风味阈值较低[34]。在HPEC、RCEL 和50CES 中均检测到的2,5-二甲基吡嗪呈现出较强的果仁香气，并且经过真空浓缩后50CES 中的2,5-二甲基吡嗪含量有所提高，说明2,5-二甲基吡嗪物质相对不容易挥发。在吉思茹[30]的报道中，2,5-二甲基吡嗪对蒸制中华绒螯蟹的谷物味具有关键性贡献。吲哚类化合物具有极强的挥发性和浓烈的焦油气味，但浓度低于0.2 μg/mL 时具有令人相当愉快的气味[35]，是构成蟹肉风味成分的物质之一。

3 结论

电子鼻试验结果表明：相较于真空浓缩体积来说，真空浓缩温度对蟹味的变化影响显著。GCMS 分析结果表明，4 组样品共有8 大类36 种挥发性风味物质被检出，主要有醛类5 种、醇类2 种、酯类4 种、酮类5 种、烃类6 种、酚类2 种、醚类1 种、杂环类（包括喹啉、吡嗪、吲哚）11 种等。4 组样品中的挥发性风味物质的含量大小关系为RCEL＞50CES＞HPEC＞50EW，其值分别为13.9753、8.3862、6.2235、1.0855 μg/L，RCEL 经过50 ℃的真空浓缩后，风味物质含量明显降低。根据GC-MS 结果分析发现，形成蟹味的物质可能是由醛类（苯甲醛、大茴香醛、3-乙基苯甲醛和2,4,5-三甲基苯甲醛）、酯类（N-苯甲酰基甘氨酸甲酯）、酮类（丁酰基丙酮和苯亚甲基苯乙酮）、烃类（2,2-二甲基十四烷、十一烷、9-辛基-二十烷和正二十烷）、醚类（4-烯丙基苯甲醚）和杂环类（2,5-二甲基吡嗪）等构成的。