患有坏死性小肠结肠炎的早产儿肠道菌群分析

王英豪，戴立英

1 苏州大学附属第二医院儿科，江苏苏州 215008；2 安徽省儿童医院新生儿科

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生儿期最常见的胃肠道急症，主要见于早产儿，极低出生体质量（＜1 500 g）早产儿中发病率5%～10%［1］。NEC的病死率高达20%～30%［2-3］。NEC主要表现为不同程度肠坏死，以缺血性肠坏死为主要病理特征，治疗不及时可并发肠外营养相关的胆汁淤积和肝功能障碍、营养不良、代谢性骨病、短肠综合征、脓毒症、严重感染和神经认知障碍［4］。目前，NEC的确切病因仍未完全了解，研究普遍认为NEC的发病可能是多因素导致的，可能包括细菌定植异常、免疫不成熟、肠屏障功能不成熟、微血管发育不全等。健康的肠道环境可以有助于早产儿减少肠道炎症和损伤。异常定植的细菌可导致早产儿肠道微生物群落紊乱。NEC早产儿的肠道菌群多样性是否与正常新生儿不同，目前相关研究较少。为此，我们对患有NEC 早产儿的肠道菌群结构进行分析，旨在为后续NEC的诊疗提供理论依据。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2020 年1 月—7 月安徽省儿童医院收治的早产儿66 例，发生NEC 44 例（观察组，其中观察1 组22 例、观察2 组22 例）、未发生NEC 22例（对照组）。观察组纳入标准：①符合NEC临床诊断标准，Ⅰ期为“可疑”期，X 线片以胃潴留和轻度腹胀为特征；Ⅱ期为“肠梗阻”期，主要表现为肠梗阻、水肿、肠壁积气征等；Ⅲ期为疾病的晚期，进展迅速恶化，易发生肠坏死、脓毒性休克、消化道出血，穿孔等严重并发症；②明确诊断NEC Ⅱ或Ⅲ度的早产儿；③标本收集前后均不使用免疫制剂及微生物制剂。排除标准：排除肠闭锁、巨结肠等肠道发育畸形患儿。对照组纳入标准：①同期在安徽省儿童医院住院的早产儿；②对照组的日龄、胎龄、出生体质量、喂养方式、出生方式等临床特征与NEC 组基本匹配，避免引起潜在NEC 及菌群失调的因素；③标本收集前后均不使用免疫制剂及微生态制剂。排除标准：排除肠闭锁、巨结肠等肠道发育畸形患儿。观察组中男10 例、女12 例，出生胎龄（35 ± 2）周，出生体质量（2 274 ± 236）g；剖宫产率41%（9/22），母乳喂养率36%（8/22）；对照组中男10例、女12例，出生胎龄（35 ± 3）周，出生体质量（2 358 ± 227）g，剖宫产率41%（9/22），母乳喂养率36%（8/22）。 本研究已通过安徽省儿童医院伦理委员会批准（EYLL-2017-023），并获得患儿父母或监护人书面知情同意。观察组采取禁食、抗感染、维持内环境稳定、支持治疗等综合管理；对照组针对原发病进行对症治疗、抗感染、维持内环境稳定、支持治疗等综合管理。

1.2 三组患儿肠道菌群检测 观察1 组在诊断NEC 24 h 内、对照组于入院24 h 内收集粪便标本，观察2 组在治疗后（NEC 临床症状明显好转，全量喂养时）采用一次性无菌粪便采集管从患儿尿布上收集粪便标本。采用16S rRNA 基因高通量测序技术检测三组患儿粪便肠道菌群DNA，明确肠道菌群种类，测算三组肠道菌群多样性指数（Shannon 指数、Sobs 指数、Simpson 指数及Chao 值）。① 粪便DNA提取：粪便DNA 的提取采用试剂盒的方法，所用试剂盒为德国QIAGEN 公司生产的QIAamp Stool Mini Kit。完成基因组DNA 提取后，采用1%琼脂凝胶电泳检测抽取的基因组DNA。② PCR 扩增：指定测序区域，合成含有barcode 的特异引物。用于16S rRNA V3 区 PCR 扩增的引物：338F：（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’），806R：（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。③ Miseq 测序及生物信息分析：Miseq 测序得到的PE reads 首先根据overlap 关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后进行OUT 聚类分析和物种分类学分析，基于OUT 聚类分析结果，可以对OUT 进行多种多样性指数分析以及对测序深度的检测；基于分类学信息，利用Circos 软件测算每组样本的物种组成比例。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行数据处理。正态分布计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以%表示，组间或细菌种属者统计学差异采用Mann-Whitney 检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组患儿肠道菌群类型比较 观察1 组和对照组共有63 种菌群种类，独有菌群种类分别为27、23 种。观察2 组和对照组共有67 种相同菌群种类，独有菌群种类分别为23、23 种。观察1 组患儿肠道菌群的优势菌群主要为肠球菌（40%）、厚壁菌门（21%）、变形菌门（23%）、双歧杆菌（10%）；观察2 组患儿肠道菌群的优势菌群主要为大肠杆菌（28%）、肠球菌（21%）、双歧杆菌（28%）、厚壁菌门（8%）、变形菌门（5%）；对照组肠道菌群的优势菌群主要为大肠杆菌（42%）、肠球菌（25%）、双歧杆菌（30%）、厚壁菌门（2%）。观察1 组与对照组患儿肠道菌群种类构成比较，P＜0.05；观察1 组与观察2 组患儿肠道菌群种类构成比较，P＜0.05。

2.2 三组患儿肠道菌群多样性比较 观察1 组、观察2 组及对照组患儿肠道菌群Shannon 指数分别为0.93 ± 0.50、0.91 ± 0.51、1.10 ± 0.34；Sobs 指数分别为19.36 ± 7.08、21.23 ± 6.43、21.96 ± 4.76；Simpson 指数分别为0.51 ± 0.26、21.23 ± 6.43、0.46 ± 0.16；Chao 值分别为22.16 ± 7.62、24.25 ±7.10、25.44 ± 6.97。三组肠道菌群多样性指数间比较，P均＞0.05。

3 讨论

NEC 是一种危及生命的消化系统疾病，常发生于早产儿，以肠缺血坏死为特征，除了发病率和病死率较高，肠狭窄粘连、胆汁淤积、短肠综合征、发育不良和神经发育迟缓等长期并发症发病率较高。肠道微生物群落拥有数千种细菌，它们在维持体内微生物平衡方面起着至关重要的作用，NEC 作为一种典型的肠道感染性疾病，肠道微生物菌群失调参与NEC 的发病机制［5］。PATEL 等［6］研究表明正常菌群可在上皮细胞表面的生长繁殖形成生物屏障，优先占领生存空间，抑制外来致病菌的定植，当肠道菌群正常的定植过程遭到破坏或延迟，将导致菌群结果发生改变，使正常菌群与宿主间的生态平衡失调，一些正常菌群成为机会致病菌，触发炎症反应，导致NEC的发生。

虽然肠道微生物菌群对NEC 的发展至关重要，但它们在其发病机制中的确切作用仍不清楚［7］。在过去的几十年里，高通量测序已经成为评估粪便和其他人体基质中微生物群落的一种非常流行的方法［8］，最常见的是通过对细菌16S rRNA 基因进行测序，使研究人员能够获得肠道内微生物多样性信息，以帮助识别与疾病相关的微生物组变化。在本研究中我们使用高通量测序技术，针对16S rRNA 基因的v3～v5 区发现观察组治疗前后和对照组菌群丰度无明显差异，且NEC 组和对照组之间的Shannon 指数和Chao1 指数没有显著差异，表明菌群多样性的缺乏并非NEC 发生的关键因素，与DOLLINGS 等［9］研究一致。同时通过本研究测序结果发现观察组治疗前后和对照组菌群种类存在显著差异，其中观察组（治疗前）以肠球菌、厚壁菌门、变形菌门为主，而观察组（治疗后）和对照组以肠球菌、双歧杆菌为主，提示厚壁菌门及变形菌门优势，且双歧杆菌减少可能导致NEC发生。 LINDBERG 等［4］对5例NEC患儿和5 例匹配对照患儿粪便样本进行16S rRNA 基因测序分析，发现NEC 患儿中变形杆菌丰度较高，双歧杆菌丰富较低，与本研究一致。STEWART 等［10］采用16S rRNA 基因测序技术对13 例NEC 患儿术后切除肠段和16 例自发性穿孔术后切除肠段对比研究发现，NEC 患儿切除肠段中变形杆菌及厚壁菌门相对丰度较高，且微生物多样性较低。有研究表明胎龄越小NEC 发病率越高［11］，确诊时的中位胎龄往往随着胎龄的增加而减少，提示在发育中的肠道中，微生物定植和微生物识别受体的表达水平之间的联合作用可能对NEC 的发生很重要。在对动物模型和手术切除的早产儿肠道研究表明，变形杆菌在肠道中通过识别G-脂多糖并激活TLR-4 后，可通过诱导微生物相关分子模式（microbe-associated molecular patterns， MAMPs）激活特定的TLRs，开启特异性免疫反应，通过激活转录因子NF-κβ 启动炎症级联反应，反过来引起肠上皮细胞凋亡和炎症因子（IL-1、IL-6、TNF-α）过度释放，更容易引起细胞因子介导的肠系膜血管炎症，破坏肠道免疫功能，造成肠组织局部缺血坏死，被认为是NEC发病的关键［12-13］。

本研究中经治疗后的NEC 患儿和非NEC 患儿双歧杆菌丰度较高，提示双歧杆菌丰度较高的早产儿不容易发生NEC［14-15］。肠道微生态失调作为NEC发展的高危因素，使得益生菌作为单菌株或多菌株活微生物补充剂在早产和足月新生儿中进行了大量研究，其中以双歧杆菌和乳酸杆菌是最为常见。LUESCHOW 等［16］一项对小鼠NEC 模型研究表明双歧杆菌可通过减少炎症细胞因子释放，降低肠上皮细胞通透性和增强肠上皮细胞中的紧密连接，改善肠道上皮屏障来预防NEC 的发生。另外一项动物观察表明在妊娠和哺乳期间，小鼠通过母体给予嗜酸乳杆菌和双歧杆菌可促进肠道发育，改善肠道屏障功能，减少断奶前炎症反应［17］。李忠堂等［18］以87 例NEC 早产儿为研究对象，分析其病原体特点，观察不同治疗方法对患儿血清炎症因子的影响，并通过Logistic 回归分析影响NEC 患儿预后的危险因素，发现双歧杆菌干预可显著降低NEC 早产儿血清IL-1β、IL-10 水平及TLR-4 表达。杨小庆等［19］对220 例早产儿随机接受双歧杆菌补充研究指出，接受双歧杆菌补充早产儿胃潴留、腹胀及NEC 发生率均较未补充早产儿低。HAGEN 等［20］一项多中心对照试验发现出生后第一个月单独给予双歧杆菌的早产儿NEC发生率明显降低。

综上所述，NEC 患儿与正常早产儿的肠道菌群种类构成没有差异。与正常早产儿比较，NEC 患儿肠道菌群厚壁菌门及变形菌门的丰度增加，双歧杆菌丰度减少。肠道菌群多样性可能不是NEC 发生发展的关键，补充外源性双歧杆菌可能有效减少早产儿NEC的发生。