miR-200a对宫颈癌细胞系HeLa增殖、迁移、侵袭调控作用观察及其靶向mRNA和lncRNA预测分析

蔡添娥，陈丽婷，于英

上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心海南医院产前诊断中心，海南三亚 572000

宫颈癌是全球女性三大常见恶性肿瘤之一，发病率和病死率逐年升高。人类乳头瘤病毒（HPV）持续感染是宫颈癌的主要危险因素，宫颈癌的发生发展还受环境、基因影响［1-2］。宫颈癌筛查、诊断和治疗方法是目前宫颈癌的临床研究热点。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一类约23 个碱基的单链非编码RNA，可通过碱基互补配对与mRNA 的3'非编码区 （3'UTRs）结合，调控mRNA 的转录或降解该miRNA。miRNA 在细胞增殖、细胞凋亡、基因甲基化等生物学过程中发挥重要作用［3］。miRNA 异常表达可促进细胞生长、侵袭和转移，抑制细胞凋亡和细胞分化，最终导致细胞生长失控，引发肿瘤［4］。研究［5-6］发现，宫颈癌组织、细胞系和宫颈癌患者血浆中miR-200a 均呈异常低表达，miR-200a 表达与宫颈癌患者的预后、转移有关，可作为宫颈癌的预后预测指标。生物信息学分析表明，miR-200a 可通过与多个下游靶mRNA作用，调控细胞的运动能力，进而影响宫颈癌的转移［6］。长链非编码RNA（lncRNA）可以发挥“海绵作用”与miRNA 结合，从而减少miRNA对mRNA 表达的抑制作用［7］。因此miRNA 可与其靶向mRNA和lncRNA共同调控细胞的生物学过程。目前miR-200a 对宫颈癌增殖、凋亡及迁移的影响及其具体作用机制尚不明确。2022年3—9月，我们观察了miR-200a 表达上调或下调后对宫颈癌细胞系HeLa 增殖迁移和侵袭的调控作用，运用生物信息学方法分析miR-200a 的靶向mRNA、靶向lncRNA及其生物学功能，以期为宫颈癌临床诊断及靶向治疗提供理论依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人宫颈癌细胞系HeLa、SiHa、CaSki、C33A及人正常上皮293T细胞由南方医科大学提供；胰蛋白酶、胎牛血清和DMEM 培养基均购自美国Gibco公司；Lipofecta mineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen 公司；miRNA 合成物和PCR引物由上海吉玛公司合成；TRIzol、反转录试剂和SYBR®PCR试剂盒均购自大连TaKaRa公司；CCK-8试剂盒购自南京凯基公司；结晶紫购自碧云天生物技术研究所；Matrigel 购自美国BD Bioscience 公司；8.0 μm孔径Transwell小室购自美国Millipore公司。

1.2 受试细胞系筛选、HeLa 细胞分组及miRNA 模拟物、miRNA 抑制物转染方法 ①取293T、HeLa、SiHa、CaSki、C33A 细胞，采用qRT-PCR 法检测细胞检测miR-200a。TRIzol 试剂提取各组细胞总RNA，反转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA，再用SYBR®PCR 试剂盒进行qPCR 检测，用于PCR 的基因和引物如下：miR-200a上游引物为5'-UAACACUGUCUGGUAACGAUGU-3'，下游引物为5'-CAG CCACAAAAGAGCACAAT-3'；内部参照基因U6 上游引物为5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，下游引物为5'-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。 以2-ΔΔCT代表基因的相对表达量。重复检测3 次，取平均值。293T、HeLa、SiHa、CaSki、C33A细胞miR-200a相对表达量分别为1.02 ± 0.05、0.44 ± 0.10、0.68 ± 0.14、0.58 ± 0.21、0.88 ± 0.34。HeLa、SiHa、CaSki 细胞miR-200a 相对表达量均低于293T细胞（P均＜0.05），其中HeLa 细胞miR-200a 相对表达量最低，因此选取HeLa细胞为后续研究对象。②取对数生长期HeLa细胞，1.2×105/孔铺于6孔板，分为1-4 组，每组6 个复孔，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，细胞培养箱温度37 ℃、CO2体积分数为5%，培养至细胞密度70%～80%时进行转染。取无血清培养基稀释miRNA 合成物（100 pmoL）和LipofectamineTM2000（0.25 μL），混合后静置20 min 并加入6 孔板。对数生长1、2、3、4 组细胞分别转染miRNA 模拟物miR-200a mimics、miRNA 抑制物miR-200a inhibitor、mimics NC、inhibitor NC。转染后培养4～6 h 更换含血清DMEM 培养基，培养48 h 时进行后续实验。

1.3 各组细胞miR-200a 检测 培养48 h 时取各组细胞，采用qRT-PCR 法检测miR-200a。操作方法同“1.2”，重复检测3次，取平均值。

1.4 各组细胞增殖情况观察 采用CCK8 法。培养24 h时取各组细胞， 5×103/孔铺于96孔板，每组5个复孔。检测时细胞加入CCK8 试剂10 μL /孔，并于培养箱孵育1.5 h 后用酶标仪测定在450 nm 处的光密度（OD）。以OD 值代表各组细胞的增殖能力，重复检测3 次，取平均值。每24 h 检测1 次，连续检测4次。实验重复检测3次，取平均值。

1.5 各组细胞侵袭能力检测 采用Transwell 小室。培养48 h 时取各组细胞，在铺细胞前进行基质胶铺胶。Matrigel 胶于4 ℃溶解，用DMEM 培养基按照体积1：8 稀释，70 μL/孔铺于Transwell 小室上室，下室加700 μL 含血清DMEM 培养基，细胞继续培养24 h 后取出上室并吸干液体，PBS 缓冲液清洗两次。无水甲醇室温固定20 min，PBS 清洗两次后0.1%结晶紫染色15 min。37 ℃放置过夜后加50 μL/孔无血清培养基，37 ℃放置30 min。于倒置显微镜下随机取3 个视野拍照（×200），计算各组侵袭细胞数。重复检测3次，取平均值 。

1.6 各组细胞迁移情况观察 采用Transwell 小室、细胞划痕实验。培养48 h时取各组细胞，所有操作均同“1.5”，测算各组迁移细胞数。取各组细胞，待细胞融合度为100%时，用200 μL 枪头均匀划3条划痕。PBS 洗去划下的细胞，加无血清培养基继续培养。分别于培养0、24、48 h 时于显微镜下随机取3个视野拍照（×10），并计算各组细胞迁移率。细胞迁移率=［Δ划痕距离/划痕距离（0 h）］×100%。实验重复3次，取平均值。

1.7 miR-200a 的靶向mRNA、靶向lncRNA 预测及其生物学功能分析

① miR-200a 的靶向mRNA 和靶向lncRNA 预测运用数据库microT-CDS（http：//www. microrna. gr/microT-CDS） 、 miRDB （http：//www. mirdb. org/miRDB/）、 TargetScan（http：//www. targetscan. org/vert_72/）预测miR-200a 的靶向mRNA，将三个数据库得到的靶mRNA 取交集后获得高可信度的miR-200a 靶向mRNA，进行后续分析。使用DIANA-Lnc-Base V2（http：//carolina. imis. athena-innovation. gr/diana_tools/web/index. phpr=lncbasev2% 2Findex）数据库，预测模式选择实验验证，组织选择宫颈，预测对miR-200a具有靶向作用的lncRNA。

② miR-200a 靶向mRNA 和靶向lncRNA 功能分析 用DAVID（https：//david. ncifcrf. gov/）网站分析宫颈组织miR-200a 靶向mRNA 和lncRNA 的功能。背景基因为人类全基因组，分析严谨度中等，采用进行基因本体论（GO）功能注释和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集聚类分析，GO 功能注释包括生物功能（Biological Process， BP）和分子功能（Molecular Function， MF）。使用STRING （http：//string. Db.org）在线分析宫颈组织miR-200a 靶向mRNA、lncRNA 编码蛋白的相互作用，用相互作用分数大于0.7 的靶基因蛋白绘制靶基因蛋白相互作用网络图。筛选与5 个或以上蛋白具有相互作用的蛋白的靶基因为作用网络的关键节点基因。

1.8 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组比较采用独立样本均数t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HeLa细胞miR-200a相对表达量比较 培养48 h时1、2、3、4组细胞miR-200a相对表达量分别为193.98 ± 10.84、0.36 ± 0.04、1.01 ± 0.16、1.04 ±0.32，与3 组比较，1 组细胞miR-200a 相对表达量升高，与4 组比较，2 组细胞miR-200a 相对表达量降低（P均＜0.05）。

2.2 各组细胞增殖能力比较 培养24、48、72、96 h时各组细胞增殖能力比较见表1。

表1 培养24、48、72、96 h时各组细胞增殖能力比较（± s）

注：与3组比较，*P＜0.05；与 4组比较，#P＜0.05。

组别1组2组3组4组细胞增殖能力培养24 h 0.35 ± 0.00 0.40 ± 0.01 0.35 ± 0.01 0.38 ± 0.04培养48 h 0.60 ± 0.03 0.65 ± 0.01 0.64 ± 0.01 0.63 ± 0.01培养72 h 0.94 ± 0.01*1.92 ± 0.03#1.37 ± 0.04 1.45 ± 0.04培养96 h 1.72 ± 0.08*2.56 ± 0.02#2.10 ± 0.10 2.07 ± 0.01

2.3 各组细胞侵袭、迁移细胞数及细胞迁移率比较 培养48 h 时1、2、3、4 组侵袭细胞数分别为（24.67 ± 5.69）、（144.00 ± 30.81）、（60.67 ±8.14）、（61.33 ± 14.05）个；迁移细胞数分别为（18.66 ± 6.51）、（134.00 ± 29.05）、（44.33 ±7.02）、（69.00 ± 11.53）个。与3组比较，1组侵袭细胞数、迁移细胞数少；与4 组比较，2 组侵袭细胞数、迁移细胞数多（P均＜0.05）。1、2、3、4 组培养24 h时细胞迁移率分别为10.53% ± 2.97%、22.58% ±2.94%、26.19% ± 1.49%、44.83% ± 3.51%，培养48 h 细胞迁移率分别为43.37% ± 1.17%、46.66% ± 3.38%、47.53% ± 1.59%、59.64% ±4.22%。与3 组比较，培养24、48 h 时1 组细胞迁移率低；与4组比较，培养24、48 h时2组细胞迁移率高（P均＜0.05）。

2.4 miR-200a 的靶向mRNA、靶向lncRNA 及生物学功能 microT-CDS、miRDB、TargetScan 数据库分析得到宫颈组织中miR-200a 的靶向mRNA 分别为201、438、3 225 个，三者交集最终得到83 个高可信度宫颈癌组织中miR-200a 靶向mRNA。 DIANA-LncBase V2 数据库分析得到6 个宫颈组织中对miR-200a 具有靶向作用的lncRNA。83 个宫颈组织miR-200a 的靶向mRNA 可聚类成16 个BP、11 个MP 和3 个KEGG 信号通路集群，主要涉及转录调控、自噬体组装、神经元迁移和轴突导向等生物学过程，DNA、RNA 结合等分子功能，Wnt信号通路、Hippo 信号通路和内质网蛋白加工信号通路。MAPK8、PSEN1、YAP1 蛋白是宫颈组织miR-200a 靶基因蛋白相互作用网络的关键节点。

3 讨论

miRNA 是肿瘤发生发展的重要调控因子，对肿瘤干细胞、上皮间质转化和肿瘤微环境具有重要的调控作用。肿瘤细胞的调控通常由多个miRNA 共同作用，它们具有相似的化学结构和作用模式［4，8］。miR-200 家族共包含五个成员：miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429。研究［6，9］表明，miR-200家族与多种肿瘤相关，不同成员在不同肿瘤中可作为抑癌基因，也可作为致癌基因。

研究［10］发现，miR-200a 在膀胱癌组织中异常高表达，可以上调基质金属蛋白酶MMP-2 表达，从而促进膀胱癌细胞侵袭，但并不影响细胞迁移能力。miR-200a 在卵巢癌组织和细胞中高表达，可靶向抑制PCDH9基因表达，最终促进卵巢癌细胞增殖和侵袭［11］。miR-200a 在膀胱癌和卵巢癌发生发展中发挥了促进作用，但在某些癌症疾病中则发挥抑癌基因的作用。在胃癌组织中，miR-200a 低表达时，miR-200a 靶向作用于KLF12 基因，抑制胃癌细胞增殖和迁移，并将细胞阻滞于G1/S 期［12-13］。miR-200a在黑色素瘤中低表达，miR-200a 水平的降低与黑色素瘤患者预后不良有关。miR-200a 可通过抑制GOLM1 基因表达，调控PI3K/Akt 信号通路和上皮间质转化抑制黑色素瘤的进展［14］。miR-200a 在不同肿瘤中发挥的作用不同，说明miR-200a 的表达具有疾病种类特异性。miR-200a 对不同肿瘤细胞的调控机制也不一致，但基本集中在细胞增殖和侵袭能力的调控。miR-200a 在宫颈癌中的研究目前还停留在检测miR-200a 在组织、细胞和血浆中的表达，并且都呈低表达［5］。有关miR-200a 在宫颈癌细胞中的调控机制目前尚未见报道。本研究结果在细胞水平证实了miR-200a 可显著抑制宫颈癌HeLa 细胞的增殖、迁移和侵袭能力，说明miR-200a 在宫颈癌中发挥着抑癌作用。

肿瘤发生发展受多种基因共同调控，miR-200a的上游和下游调控基因亦有多种，形成复杂的调控网。通过在线预测miR-200a 下游靶向mRNA 并对其进行功能分析，结果表明ZNF家族基因、KLF家族基因、ZBTB41等多个靶基因编码蛋白为转录调控因子，功能与转录调控密切相关。信号通路预测则富集于Wnt 信号通路和Hippo 信号通路。Wnt 信号通路是促发宫颈癌的关键通路，FZD 作为其下游调控基因共同参与调控宫颈癌的发生、发展［15］。Hippo-YAP 信号通路由一系列蛋白激酶和转录因子构成，作为肿瘤抑制的一个重要信号通路，可通过影响细胞的增殖、凋亡、侵袭与迁移等生物学进程进而参与肿瘤的发生［16］。有研究［17］显示Hippo-YAP信号通路可影响宫颈癌微环境中各种非肿瘤细胞的生物学，与EGFR信号通路和HPV癌蛋白共同调节宫颈癌发生发展［18］。本研究中，FZD1 和YAP1 为miR-200a 的预测靶基因，且参与Wnt 信号通路或Hippo 信号通路，YAP1 在靶基因编码蛋白作用网络中还处于关键节点位置。miR-200a 抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力可能是通过调控Wnt- FZD1信号通路或Hippo-YAP1 信号通路。其具体分子机制有待进一步实验验证。

miR-200a 可通过下调其下游mRNA 的表达水平，调控下游信号通路，同时也受上游lncRNA 或基因的调控。lncRNA、miRNA、mRNA 之间形成了紧密的竞争性内源性RNA 调控网络［19］。研究［20］发现，在缺氧条件下的在肝癌细胞中，LncRNA MALAT1可吸附miR-200a，使其调控功能下降，从而抑制细胞增殖和侵袭。在乳腺癌中，FEN1 可介导miR-200a 甲基化，使miR-200a 表达下调，并激活表皮生长因子受体信号通路、促进上皮间质转化，导致乳腺癌恶化［21］。LncRNA H19 和LncRNA MALAT1 在肺癌中通过海绵作用抑制miR-200a 调控ZEB1 和ZEB2 表达功能，进而促进肺癌细胞增殖和转移［22-24］。本研究中，我们在LncRNA 数据库中查询到LncRNA MALAT1 在宫颈癌HeLa 细胞中与miR-200a 可靶向结合，LncRNA MALAT1 可能通过吸附miR-200a，从而抑制miR-200a 对mRNA 的调控作用，最终促进宫颈癌HeLa细胞增殖和侵袭。

综合本研究对miR-200a 下游mRNA 和上游lncRNA 的预测分析，miR-200a对宫颈癌的抑制作用也可能受到多个lncRNA的调控，并随后影响下游靶基因的表达。miR-200a 可能与ZNF 家族基因、KLF家族基因、FZD1、YAP1 等基因，以及lncRNA MALAT1 共同作用，形成宫颈癌调控网络。而其相互作用机制及其对宫颈癌细胞的影响还有待进一步深入探索。

综上所述，上调miR-200a 表达可抑制HeLa 细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制miR-200a 表达可促进HeLa细胞的增殖、迁移和侵袭。miR-200a可能通过转录调控、核酸结合等生物学过程，Wnt 信号通路、Hippo 信号通路及内质网蛋白加工信号通路，参与调控宫颈癌的增殖、迁移和侵袭。miR-200a 可能作为预防、诊断和治疗宫颈癌的一个潜在生物标志物。