超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4在大鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞中的表达*

贾丹丹 许亚平 郭志坤，△

（1 新乡医学院河南医用组织再生重点实验室，新乡 453003；2 郑州第七人民医院，郑州 450000）

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gated cation channel 4，HCN4）主要表达于哺乳动物窦房结组织的起搏细胞[1-4]，因此HCN4 基因又被称为心的起搏基因。Seifert 等[5-6]报道HCN4 高表达于胚胎心和人类的丘脑，窦房结细胞舒张期自动去极化与HCN4 有密切的关系，它已被确定为心率的调节器。HCN4 离子通道的突变或缺失可能导致心律失常、窦房结功能障碍[7]和心肌致密化不全。HCN4 对心传导系统的功能发育非常重要，小鼠胚胎期的HCN4 功能缺失，导致小鼠后续的生长发育终止[8]。HCN4 作为窦房结细胞产生超级化激活内向离子电流（If）的主要离子通道，在心4 期自动去极化中发挥很重要的作用[8-11]。HCN4 除在心传导系统表达外，在组织水平的动脉、静脉、心外膜、心内膜、平滑肌细胞、成纤维细胞、少数心肌细胞均有表达[12]，但是在体外细胞水平是否与组织水平的表达一致，以及不同代次的细胞和不同年龄的心HCN4 表达规律及其一致性，目前研究甚少。本研究试图从细胞水平和组织水平进一步探讨成纤维细胞和心肌细胞HCN4 的表达变化规律，为进一步深入探讨HCN4 对心率调控和心发育的增龄变化奠定形态基础和理论参考。

1 材料和方法

1.1 动物

SD 大鼠39 只，其中新生1～3 d 大鼠15 只用于原代细胞培养；新生组（1～3 d）、成年（17 个月）和老年（22 个月）SD 大鼠各8 只，每组中4 只用于冰冻切片，剩余4 只用于实时荧光定量PCR（qRTPCR）。雌雄不限，由新乡医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（豫） 2010-0002。对动物的实验处理方法遵照中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 原代成纤维细胞和心肌细胞分离培养

15 只新生1～3 d SD 大鼠在无菌条件下取出心，将其放入预冷的PBS 中，冲洗6 次以除去血细胞，剪去大血管、结缔组织，用眼科剪将心剪成1 mm×1 mm×1 mm 小块，加入0.1%Ⅱ型胶原酶和等体积的0.2% 胰蛋白酶，37℃消化8 min；用无菌一次性吸管吹打，使其混匀、静置，吸取管中的上清液，加入相同体积的低糖完全培养基终止消化；重复上述消化，收集上清液，终止消化等步骤10～13 次，直到组织块完全消化为止；过滤全部上清液，转速1 200 r/min，离心5 min，弃上清液，用无菌吸管吸取4 mL 完全培养基，缓慢吹打，充分混匀，并接种至培养瓶中，将培养瓶放置在CO2含量为5%的37℃培养箱45 min；取出培养瓶，吸去上清液，原培养瓶加入4 mL 完全培养基，将上清液加入新的培养瓶中，将其放置于培养箱中培养45 min。重复上述操作，采取差速贴壁法分离纯化心肌细胞，取上清液接种到新的培养瓶获得心肌细胞，原培养瓶加4 mL 完全培养基获得成纤维细胞，24 h 后首次换液，根据培养基的颜色变化2～3 d 更换1 次培养基。

1.3 免疫细胞化学显色

取4%多聚甲醛固定过的成纤维细胞爬片和心肌细胞爬片，PBS 冲洗，用0.3%的Triton X-100作用10 min，PBS 冲洗，用3% H2O2室温15 min，PBS 冲洗，用10% 山羊血清室温封闭20 min，分别滴加一抗：成纤维细胞爬片分别滴加小鼠抗大鼠多克隆抗体DDR2（1∶25，Santa Cruz 公司）、兔抗大鼠多克隆抗体HCN4（1∶600，Bioss 公司）。心肌细胞爬片分别滴加小鼠抗大鼠多克隆抗体cTnT（1∶200，Affinity 公司） 、兔抗大鼠多克隆抗体HCN4（1∶600，Bioss 公司）。4℃孵育过夜。空白对照用PBS 代替一抗，其余操作同实验组。第2 天取出爬片，PBS 冲洗，滴加相应的二抗工作液，室温孵育30 min，PBS 冲洗，DAB 显色，显色时间不超过30 s，冲去多余染液，苏木精染色2 min，除去多余染液，用0.7%盐酸乙醇分化12 s，冲去多余染液，脱水，透明，封片。用显微镜观察，拍照，留存图像。

1.4 免疫荧光细胞化学染色

取4%多聚甲醛固定过的成纤维细胞、心肌细胞的孔板，PBS 冲洗，用0.3%的Triton X-100 作用10 min，PBS 冲洗，山羊血清室温封闭40 min，分别滴加一抗：成纤维细胞滴加小鼠抗大鼠多克隆抗体DDR2（1∶25，Santa Cruz 公司）和兔抗大鼠多克隆抗体HCN4（1∶200，Bioss 公司）。心肌细胞滴加小鼠抗大鼠多克隆抗体cTnT（1∶500，Abcam 公司）和兔抗大鼠多克隆抗体HCN4（1∶200，Bioss 公司）。4℃过夜，第2 天PBS 冲洗，分别滴加相应二抗，室温避光孵育2 h，PBS 冲洗，DAPI 室温孵育3 min，PBS 冲洗，用抗荧光淬灭封片剂封片，对照组一抗用PBS 代替，其余步骤相同。荧光显微镜下观察并拍照。

1.5 心肌免疫组织化学染色

取新生、成年和老年SD 大鼠心，用恒冷箱冷冻切片机切片，片厚8 μm。室温复温15 min，丙酮固定10 min，PBS 冲洗，用3% H2O2室温10 min，PBS 冲洗，用10% 山羊血清室温封闭40 min，滴加兔抗大鼠多克隆抗体HCN4（1∶600，Bioss 公司）。第2 天取出切片，PBS 冲洗，滴加相应的二抗工作液，室温孵育30 min，PBS 冲洗，滴加DAB 显色30 s，自来水冲洗10 min，苏木精染色2 min，除去多余染液，用0.7%盐酸乙醇分化2 s，用自来水冲洗1 min，经脱水，透明，封片。显微镜下观察拍照。

1.6 心肌组织免疫荧光染色

取新生、成年和老年SD大鼠心冷冻切片，PBS冲洗，用0.3%的Triton X-100作用15 min，PBS冲洗，山羊血清室温封闭40 min，分别滴加一抗，组织切片滴加小鼠抗大鼠多克隆抗体DDR2（1∶25，Santa Cruz 公司）和兔抗大鼠多克隆抗体HCN4（1∶200，Bioss 公司），或滴加小鼠抗大鼠多克隆抗体cTnT（1∶500，Abcam 公司）和兔抗大鼠多克隆抗体HCN4（1∶200，Bioss 公司）。第2 天PBS 冲洗，分别滴加相应二抗，室温避光孵育2 h，PBS 冲洗，DAPI 室温孵育3 min，PBS 冲洗，用抗荧光淬灭封片剂封片，对照组一抗用PBS 代替，其余步骤相同。荧光显微镜下观察并拍照。

1.7 免疫印迹检测HCN4 蛋白表达

用 RIPA 裂解液分别提取新生、成年和老年大鼠左心室蛋白，提取P1～P4 代成纤维细胞蛋白。放冰上30 min 以保证充分裂解，待离心机温度降至4℃，14 000 r/min 离心5 min，离心后吸出上清液至新的离心管中，量取上清液体积，并加入上清液体积4/5 的5×上样缓冲液，95℃变性5 min 保存。蛋白样品于10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳并转膜，脱脂奶粉封闭1 h，一抗（兔抗大鼠HCN4 多克隆抗体，1∶500，Affinity 公司；兔抗小鼠β-tubulin 单克隆抗体，1∶10 000，Affinify公司） 孵育过夜。TBST 洗涤，二抗室温摇床孵育2 h，TBST 洗涤，ECL 化学发光法显色，并进行数据处理和分析。

1.8 qRT-PCR 检测HCN4 mRNA 表达

常规抽提新生、成年和老年大鼠左心室总RNA、P1～P4 代成纤维细胞的总RNA，并进行qRT-PCR。β-tubulin 作为内参，配制PCR 反应液，其中目的基因为HCN4。反应条件设置为95℃预变性10 min，95℃变性10 s，63℃退火15 s，72℃延伸15 s，共40 个循环。目的基因和β-tubulin 产物倍数按2-ΔΔCT计算。上海生工参与引物设计与合成。引物序列见表1

表1 PCR 扩增引物序列

1.9 统计学处理

所有数据采用 SPSS 17.0、Graphpad Prism 5.0统计学软件进行处理，多个样本均值比较采用单因素方差分析，组别之间两两比较用LSD 方法进行比较分析，数据以±s表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCN4 在成纤维细胞和心肌细胞的表达

免疫细胞化学显色结果显示，在P1～P4 代的成纤维细胞（图1A、图1B，见封二）中HCN4 呈阳性表达，表达率达100%；在原代心肌细胞（图1C，见封二）中也存在HCN4 表达，但由于原代心肌细胞中混杂有成纤维细胞，原代心肌细胞表达数量不易统计。为了排除细胞混杂，分别采用了成纤维细胞和心肌细胞的特异性标记物DDR2 和cTnT 与HCN4 进行了免疫双标，免疫荧光的结果显示，DDR2 和HCN4 在P1～P4 代成纤维细胞（图1D～图1G，见封二）中同样呈共表达，共表达率几乎100%；cTnT 和HCN4 在原代心肌细胞（图1H，见封二）中也呈现共表达，共表达率达100%，不表达的细胞为心肌以外的细胞。免疫荧光结果与免疫细胞化学结果一致。

2.2 HCN4 在新生、成年和老年大鼠心肌组织的表达

免疫组织化学显色结果显示，新生、成年和老年（图2A，见封三）大鼠心肌组织中均可见HCN4阳性表达的细胞，其中包括成纤维细胞、血管平滑肌，心肌细胞中均有表达。随着大鼠月龄的增加，心肌组织HCN4 的表达水平呈明显下降趋势。免疫荧光组织化学显色结果显示，新生、成年和老年大鼠心组织中的成纤维细胞均表达HCN4（图2B～图2D，见封三），新生大鼠心组织中的成纤维细胞HCN4的表达量高于成年和老年大鼠；在新生、成年和老年大鼠心组织中的心肌细胞均可见HCN4的表达（图2E～图2G，见封三），新生大鼠心组织中的心肌细胞HCN4的表达量高于成年和老年大鼠心肌细胞的表达。

2.3 心肌成纤维细胞HCN4 蛋白表达

免疫印迹结果显示，HCN4 蛋白在P1～P4 代成纤维细胞表达规律为P1 代成纤维细胞表达最高，P2 代后成纤维细胞表达量明显下降，P1～P4 代成纤维细胞中HCN4 表达量随代次增加表达水平逐渐下降。与P1 代比较，P2、P3 代和P4 代成纤维细胞比较差异均有统计学意义（P＜0.01，P＜0.001）（图3）。

图3 P1-P4 代成纤维细胞HCN4 蛋白表达变化

2.4 P1～P4 代成纤维细胞和新生、成年和老年大鼠左心室心肌组织HCN4 mRNA 定量分析

P1～P4 代成纤维细胞mRNA 的定量结果显示，P1 代成纤维细胞中HCN4 的mRNA 表达高于P2 代、P3 代和P4 代的mRNA 表达（P＜0.05，P＜0.01）。P1～P4 代成纤维细胞的HCN4 的mRNA的总体变化趋势是随着代次增加，表达水平逐渐减低。新生、成年和老年大鼠左心室心肌组织mRNA定量结果显示，新生大鼠心肌HCN4 的mRNA 表达高于成年、老年大鼠HCN4 的mRNA 表达（P＜0.01，P＜0.001），新生、成年和老年大鼠左心室心肌组织HCN4 的mRNA 的总体变化趋势为随着大鼠月龄的增加，其表达量逐渐下降（图4）。

图4 不同代次成纤维细胞（A）和不同月龄大鼠左心室心肌组织（B）HCN4 的mRNA 表达比较

3 讨论

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道（HCN）基因家族包括HCN1、HCN2、HCN3、HCN4 这4个成员，在心组织中有HCN1、HCN2 及HCN4 3种亚型[13]，其中与心起搏有密切关系的HCN4 被称为起搏基因[14-16]。HCN4 是具有6 个跨膜片段的蛋白，已证实表达在心房肌组织、窦房结细胞[17]，在幼年、成年、老年大鼠窦房结部位随着年龄的增加表达量逐渐降低[18-20]。目前的研究表明HCN4 除在传导系统表达外，在心的其他细胞也有表达，但HCN4 在幼年、成年、老年大鼠心传导组织以外的成纤维细胞、心肌细胞的表达变化尚未见报道。本研究从细胞和组织水平证明随大鼠月龄和成纤维细胞代次的增加，HCN4 表达量逐渐减少，这一结果提示体外和体内表达规律基本一致。但新生大鼠原代成纤维细胞、原代心肌细胞HCN4 的表达率较高，几乎达100%。与心肌组织表达比较，体外的原代心肌细胞几乎全部表达HCN4，但在组织水平只能见到部分心肌细胞表达，说明心肌细胞的表达存在体内和体外的表达差异。为了保证心肌成纤维细胞和心肌细胞的纯度，本研究对培养的细胞分别进行了DDR2 和cTnT 特异性标记，并与HCN4 阳性表达进行了叠加标识，以证明本研究所显示结果的可靠性。

在组织水平除成纤维细胞、心肌细胞表达HCN4之外，血管平滑肌细胞也表达HCN4，而且随年龄的增加其表达逐渐减少，这与笔者先前的研究结果[12]及程功等[18]研究的HCN4在幼年、成年、老年大鼠窦房结组织的增龄变化规律一致。本研究结果提示HCN4在心传导系统以外的其他细胞广泛存在，不只是胚胎时期或窦房结细胞的特异性标记物。

本研究免疫印迹结果显示，P1～P4 代成纤维细胞HCN4 蛋白的表达量随着培养代次的增加而降低，qRT-PCR 结果与免疫印迹结果基本一致，显示HCN4 的mRNA 的总体变化趋势随着代次增加，表达有降低趋势，说明HCN4 的转录和翻译具有一致性。另外，本研究体内和体外均发现所有HCN4 阳性细胞均随增龄的增长，其表达数量逐渐下降，其发生机制尚需进一步研究。

图版说明（图见封二、封三）

图1 HCN4 在体外培养心肌成纤维细胞和心肌细胞的表达，标尺=100 μm。A1、A2、A3、A4：依次为P1、P2、P3、P4 代的心肌成纤维细胞DDR2 的免疫细胞化学染色。B1、B2、B3、B4：依次为P1、P2、P3、P4 代的心肌成纤维细胞HCN4 的免疫细胞化学染色。C1、C2：依次为原代心肌细胞cTnT、HCN4 的免疫细胞化学染色。D1～D3、E1～E3、F1～F3、G1～G3：依次为P1 代、P2 代、P3 代、P4 代心肌成纤维细胞的DDR2、HCN4 免疫细胞荧光染色，DAPI 复染；D4、E4、F4、G4：依次为D1～D3、E1～E3、F1～F3、G1～G3 图的融合图；H1～H4：依次为新生大鼠原代心肌细胞cTnT、HCN4、DAPI 及融合图.

图2 HCN4 在新生、成年和老年大鼠心肌组织的表达，标尺=100 μm。A1、A2、A3：依次为新生、成年和老年大鼠心肌组织HCN4 的免疫组织化学染色。B1～B3、C1～C3、D1～D3：依次为新生、成年、老年大鼠心肌成纤维细胞DDR2、HCN4免疫细胞荧光染色，DAPI 复染。B4、C4、D4：依次为B1～B3、C1～C3、D1～D3 图的融合图。E1～E3、F1～F3、G1～G3：依次为新生、成年、老年大鼠心肌细胞cTnT、HCN4 免疫细胞荧光染色，DAPI 复染；E4、F4、G4：依次为E1～E3、F1～F3、G1～G3 图的融合图.