3 种常见金银花致病菌多重实时荧光定量PCR 检测方法研究

朱桐杉，刘艳艳，谭晴晴，刘国霞，陈雪燕，步迅，王文博，于子涵，4，张全芳，张永清

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.山东省农业科学院农作物种质资源研究所，山东 济南 250100；3.山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，山东济南 250100；4.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250013)

金银花又名忍冬花，是忍冬科植物忍冬(Lonicera japonicaThunb.)的干燥花蕾或带初开的花[1]，在我国分布广泛。 主要有效成分为黄酮类[2]、环烯醚萜类[3]、挥发油类[4]、酚酸类等[5]。其在医药领域中的应用非常广泛，具有清热解毒、通经活络、消炎消肿之功效[6]。

随着金银花种植年限的增长，病虫害也逐渐加重，以叶部病害和根部病害为主。 其中炭疽病、褐斑病和白粉病是最常发生的叶部病害，褐斑病可导致叶片枯萎脱落；金银花植株感染白粉病会导致花蕾发育畸形，严重时会大量落花；炭疽病侵染茎枝时会使枝条倒伏、枯死，影响植株生长发育，降低花蕾的产量与品质[7]。 目前对于金银花病害的检测手段较少。 传统的病原菌鉴定方法通常为病原菌分离后经过柯赫氏法则结合分子生物学进行鉴定[8]，该过程耗时长，容易延误病害防治时机。 做好金银花病害的早期检测、及时开展防治工作，有效降低化学农药施用量，对于保证金银花药材产量和质量具有重要意义。 因此建立一种快速、准确检测金银花炭疽病、褐斑病及白粉病病原菌的方法，并应用于3 种病害的早期防治是当务之急。

前期在山东省临沂市平邑县金银花主产区发现并分离出炭疽病病原菌胶胞杆菌(Colletotrichum gloeosporioides)，并验证了病原菌的致病性[9]，结合已报道的金银花主要叶部病害褐斑病病原菌鼠李尾孢(Cercospora rhamni)和白粉病病原菌(Erysiphe lonicera)，基于ITS 序列分别设计了特异引物和TaqMan 探针，通过优化PCR 体系和反应条件建立了多重实时荧光PCR 检测体系，实现了金银花炭疽病、褐斑病和白粉病病原菌的快速、准确和高通量检测，以期为及时有效地防治金银花叶部病害提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白粉病病原菌(Erysiphe lonicera)、炭疽病病原菌胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、褐斑病病原菌鼠李尾孢(Cercospora rhamni)、白绢病病原菌(Selerotium rolfsii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、金银花叶斑病病原菌(Stemphyliumsp.)、木霉菌(Trichodermaspp.)，保存于山东省农业科学院农作物种质资源研究所；用于验证试验的金银花病害样本采集于山东中医药大学药用植物园和山东省临沂市平邑县金银花产区。

高效植物基因组DNA 提取试剂盒[DP350，天根生化科技(北京)有限公司]，DNA 分子量Maker DL2000[天根生化科技(北京)有限公司]，真菌基因组DNA 提取试剂盒(Axygen)，电泳上样缓冲液[宝生物工程(大连)有限公司]。

1.2 仪器与设备

Quant Studio7Flex 荧光定量PCR 仪(美国ABI)；Takara PCR 仪[宝生物工程(大连)有限公司]；Nano Drop Lite 超微量核酸检测仪(赛默飞世尔)； 5424D 型高速离心机(Eppendorf 公司)；凝胶成像仪(Bio-Rad 公司)；UV3600 紫外可见分光光度计(日本岛津公司)。 引物和探针序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。 使用Quant StudioTMReal-Time PCR Software 软件进行绘图。 使用Microsoft Excel 软件进行表格制作。

1.3 试验方法

1.3.1 3 种病原菌特异引物及TaqMan 探针设计根据GenBank 上的鼠李尾孢菌(Cercospora rhamni，GenBank 登录号MT338042.1)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides， GenBank 登 录 号MN833335.1)及白粉病病原菌(Erysiphe lonicera，GenBank 登录号LC009992.1)序列，使用Primer premier 5.0 软件分别设计引物对和TaqMan 探针。引物及探针序列见表1。

表1 引物和探针序列

1.3.2 多重实时荧光PCR 体系构建 多重实时荧光PCR 反应体系(20 μL):2×TaqMan Master Mix 10 μL，炭疽病病原菌上、下游引物和探针各1 μL，白粉病病原菌上、下游引物和探针各1 μL，褐斑病病原菌上、下游引物和探针各1 μL，DNA模板1 μL。 褐斑病引物和探针的终浓度分别为0.50 μmol/L 和0.40 μmol/L，白粉病引物和探针的终浓度为0.50 μmol/L 和0.40 μmol/L，炭疽病病原菌引物和探针的终浓度为0.25 μmol/L 和0.10 μmol/L。

多重实时荧光PCR 扩增条件:95℃2 min；95℃10 s，60℃35 s(在此阶段收集荧光信号)，40个循环。

1.3.3 重组质粒的构建 使用1.3.1 中金银花褐斑病、白粉病及炭疽病病原菌特异引物进行基因扩增，参考李敏[10]的方法进行重组质粒构建，对重组质粒PCR 产物进行测序，验证是否正确插入目的片段。 DNA 测序在山东省农业科学院农作物种质资源研究所进行。

1.3.4 实时荧光PCR 标准曲线建立 使用UV3600紫外分光光度计测定3 种病原菌阳性重组质粒DNA 浓度，将重组质粒DNA 定量至2.94×108copies/μL，按照10 倍梯度稀释成6 个浓度，每个梯度3 次重复。 反应体系与程序按照1.3.2 进行。根据重组质粒拷贝数初始量值和阈值循环数(Ct)进行多重实时荧光PCR 体系标准曲线的构建。

1.3.5 引物和探针特异性检测 分别以胶孢炭疽菌、鼠李尾孢菌、白粉病病原菌、白绢病病原菌、木霉菌、禾谷镰刀菌、金银花叶斑病病原菌、黑曲霉的基因组DNA 为模板，按1.3.2 中多重实时荧光PCR 反应条件及反应体系进行检测，每个样本3 次重复，验证引物和探针的特异性。

1.3.6 多重实时荧光PCR 方法灵敏度验证 将重组质粒DNA 定量至2.94×108copies/μL，按照10 倍梯度依次稀释8 个浓度，每个浓度重复3次，根据荧光信号值大小，评价相应引物和探针对3 种病原菌的检测灵敏度。 同时以此DNA 模板和表1 中特异引物进行普通PCR 扩增，每个浓度重复2 次。

普通PCR 扩增体系:10×buffer 2.5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL、Taq酶(5 U)0.2 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL、DNA 模板(1～10 ng/μL)2.0 μL，ddH2O 16.3 μL；扩增程序:95℃3 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，30 个循环；72℃10 min。

1.3.7 验证试验 利用本研究建立的3 种病原菌多重实时荧光PCR 检测方法对从临沂市平邑县金银花产区、山东中医药大学药用植物园采集的15 份叶部病害样本进行检测，同时提取样本DNA、使用真菌通用引物ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3′，ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′进行PCR 扩增，切胶回收并测序。 将两种检测方法的结果进行比较，以验证本研究所建立的多重实时荧光PCR 方法的准确性与可行性。

2 结果与分析

2.1 实时荧光PCR 标准曲线建立

以重组质粒拷贝数初始量值为横坐标，Ct 值为纵坐标，得到褐斑病线性回归方程为y ＝-3.296x＋40.234，R2＝0.998；白粉病线性回归方程为y ＝-3.374x＋40.374，R2＝0.996；炭疽病线性回归方程为y ＝-3.470x＋43.092，R2＝0.996(图1)。3 种病原菌实时荧光PCR 标准曲线相关系数均大于0.99，扩增效率均接近100%，标准曲线横纵坐标间形成良好线性关系，表明该方法具有效性。

图1 3 种病原菌实时荧光PCR 标准曲线图

2.2 引物和探针特异性验证

按照1.3.5 方法进行特异性验证，当ROX 荧光修饰探针有扩增曲线且满足Ct≤35 时，说明待检样本检出炭疽病病原菌；当FAM 荧光修饰探针有扩增曲线且满足Ct≤35 时，说明待检样本检出白粉病病原菌；当JOE 荧光修饰探针有扩增曲线且满足Ct≤35 时，说明待检样本检出褐斑病病原菌；当FAM、JOE 和ROX 荧光修饰探针均无扩增曲线时，表明该检测样品为阴性。 由表2 可知，本试验建立的多重实时荧光定量PCR 方法只能特异扩增目的病原菌，对其他病原菌均无扩增，说明本研究建立的多重实时荧光定量PCR 体系的引物及探针的特异性良好。

表2 引物及探针特异性验证试验

2.3 检测灵敏度

多重实时荧光定量PCR 检测方法和普通PCR 法对金银花褐斑病、白粉病和炭疽病3 种病原菌灵敏度验证结果见图2A、B、C。 3 组重组质粒在浓度29.4 copies/μL 时，Ct 值＞35，因此多重实时荧光定量PCR 法对3 种病原菌检测最低检测限为2.94×102copies/μL；在普通PCR 扩增中，当模板DNA 浓度为2.94×104copies/μL 时有明显扩增条带，低于此浓度则无扩增条带，因此普通PCR 法 检 测 灵 敏 度 为2.94 × 104copies/μL(图2D)。 结果表明，本试验建立的多重实时荧光PCR 检测方法的灵敏度比普通PCR 法高100倍。

图2 3 种病原菌多重实时荧光定量PCR(A、B、C)和常规PCR(D)扩增体系灵敏度

2.4 验证试验

分别使用本试验建立的检测方法和DNA 测序法对实际样本进行检测，多重实时荧光定量PCR 结果检测出炭疽病病原菌阳性样本4 份、白粉病阳性样本5 份、褐斑病阳性样本6 份，检出率为100%，与DNA 测序结果完全一致(表3)。

表3 实际样本检测结果

3 讨论与结论

金银花为山东道地药材之首，主产于山东省临沂市平邑县。 以花入药，药用历史悠久。 性味甘寒，气味芳香，有清透疏表、清热解毒之效。 亦可食用，具有一定的保健功能，老少皆宜。

传统植物病原菌通常使用组织分离法结合DNA 测序法进行鉴定，如紫薯腐败菌的分离和鉴定[11]、马铃薯赤霉病病原菌的分离和鉴定[12]等，耗费时间较长。 实时荧光定量PCR 法可实现数个样品的自动化检测，成本低，较普通PCR 技术所用时间短，能在病害初期进行快速检测[13]。 目前已经建立了柑橘枯萎病病毒[14]、橄榄果实中敏感炭疽菌[15]等实时荧光定量PCR 检测方法。

褐斑病、白粉病及炭疽病是常见的3 种金银花叶部病害，也是导致金银花减产、降质的重要原因。 感染白粉病时，叶部绿原酸含量降低[16]；褐斑病、炭疽病发病后期，斑点融合导致叶片呈现圆形或不规则病斑，严重时会导致全株叶片脱落、植株枯死[17，18]，且病害后期致病菌可停留在土壤及病残体中越冬。 李志红等[19]对封丘金银花炭疽病染病植株叶片进行分离和检测，得到炭疽病病原菌为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)；研究表明金银花褐斑病病原菌为半知菌亚门鼠李尾孢(Cercospora rhamni)、金银花白粉病病原菌为Erysiphe lonicera[20，21]。

目前对3 种金银花病害的研究还停留在发病症状调查和病原菌分离鉴定阶段，防治措施是在叶部出现明显症状后进行喷洒农药或剪去带病枝条[22，23]，而针对3 种病害的分子检测方法还未见报道。 实时荧光定量PCR 技术具有操作简便、快速高效、高通量、高敏感性等特点，在分子诊断、动植物检疫以及食品安全检测等方面有广泛应用，提高了检测时效性和灵敏度。 多重实时荧光定量PCR 方法可在同一个检测体系中对多个目标序列同时进行检测，且能精确定量。 如利用实时荧光逆转录定量PCR 技术快速检测香蕉的枯萎芽孢杆菌[24]、菊花的花叶白锈菌及褐锈菌[25]、马铃薯中常见疮痂病及病原菌[26]以及检测羊奶中牛奶和大豆源性成分[27]。

本研究基于ITS 序列设计引物与TaqMan 探针，建立了可同时检测金银花褐斑病、白粉病及炭疽病3 种病害病原菌的多重实时荧光PCR 检测体系，该方法最低检测限度为2.94×102copies/μL，比普通PCR 方法提高100 倍，特异性强，可为金银花叶部病害早诊断、早防治提供技术支持，弥补了金银花炭疽病、褐斑病及白粉病病害检测方法的缺失。 但本试验未曾对多种病害同时检测进行实际样本验证，对于病原菌的鉴定停留在定性层面而未进行定量计算，因此关于多种病原菌的同时检测及其定量分析是下一步研究重点。