桃红四物汤治疗肢体缺血再灌注损伤的作用机制探讨*

程群，朱付平

1 湖南中医药大学 湖南长沙 410208

2 湖南中医药大学第一附属医院 湖南长沙 410007

肢体缺血-再灌注损伤（limb ischemia reperfusion injury，LI-RI），是指肢体在血流减少或停止后，肢体的血流恢复，肌肉等组织的受损伤程度更加严重的一种综合征[1]，是骨科疾病中致残、致死率较高的疾病之一。[2]西医治疗手段以消炎、止痛、消肿为主，对LI-RI治疗效果一般。中医认为LI-RI辨病属于股肿、脉痹等范畴，与气行不畅，血瘀脉中有关。[3]随着中医的发展，中医药在此病的治疗方面表现出一定的优势。有研究表明[4-5]桃红四物汤可以减轻炎症反应，改善血液循环，对LI-RI有着不错的治疗效果。桃红四物汤作为治疗LI-RI的有效方，其作用机制尚不清楚。本研究采用网络药理学方法研究桃红四物汤治疗LI-RI的作用机制，为临床用药和基础研究提供一定理论依据。

资料与方法

1 桃红四物汤有效成分和靶点的搜集

在中药系统药理数据库和分析平台[6]（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP）中，以口服生物利用度（OB）≥30% 和类药性（DL）≥0.18为筛选条件，分别筛选出桃红四物汤中桃仁、红花、熟地黄、当归、白芍、川芎六位中药的有效成分，然后用Uniprot数据库[7]查找与其相对应的官方基因名称，得到并整理数据后，将整理好的数据导入Cytoscape3.8.2[8]软件得到“成分-靶点”网络。

2 LI-RI靶点的搜集及韦恩图的绘制

以“Limb ischemia-reperfusion injury”“ischemiareperfusion injury”为关键词，在Gen eCards数据库[9]、OMIM数据库中[10]，检索与肢体缺血-再灌注损伤有关靶点，得到相关疾病基因靶点。将药物基因名称与疾病基因名称整理、去重后，运用Venny2.1平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），绘制韦恩图，得到药物-疾病的交集基因。

3 PPI网络构建

将得到的交集基因输入到STRING 11.5（https：//cn.string-db.org/）数据库[11]中，设置物种为“Home sapiens”（人类），得到PPI网络图和TSV文件，将TSV文件导入到Cytoscape3.8.2软件中进行分析，得到核心靶点。

4 GO富集及KEGG信号通路富集分析

将得到的交集基因靶点导入到Metascape（https：//metascape.org/）数据库中[11]，设置物种为“Home sapiens”（人类），进行GO富集和 KEGG 信号通路富集分析。GO分析包括生物过程（Biological Process，BP）、细胞组分（Cellular Components，CC）、分子功能（Molecular Functions）。利用微生信在线平台绘制富集分析柱状图、气泡图。

5 主要有效成分与核心靶点分子对接

将得到的主要有效成分和核心靶点进行整理，核心靶点的蛋白结构从PDB 蛋白数据库[12]（http：//www.pdb.org）下载；有效成分的化合物结构在Pub-Chem数据库[12]（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下载，然后使用 Autodock Vina软件进行分子对接，去验证桃红四物汤治疗LI-RI的可能核心靶点的准确性。

结 果

1 桃红四物汤活性成分及靶点

在TCMSP数据库中通过筛选，共得到69个有效成分，桃仁23个，熟地黄2个，当归2个，白芍13个，红花22个，川芎7个。以OB值排名前20为例，见表1。在Uniprot数据库查找与其相对应的官方基因名称共240个。

表1 桃红四物汤中部分有效成分

2 成分-靶点图的构建与分析

将搜集到的240个基因，去重、整理数据后，将数据导入Cytoscape3.8.2软件，得到成分-靶点网络图，见图1。该网络包含310个节点，909条边，其中菱形表示靶点基因，圆形表示有效成分，正三角形表示药物。然后运用“Analyze Network ”功能进行拓扑分析，得到度值（ Degree） 排名前三的有效成分为quercetin（槲皮素）、kaempferol（山柰酚）、luteolin（木犀草素），推测这三个成分可能是桃红四物汤治疗LI-RI的主要有效成分。

图1 成分-靶点网络

3 桃红四物汤治疗LI-RI的靶点

在GeneCards、OMIM数据库对肢体缺血-再灌注损伤或缺血再灌注损伤进行检索得到相关靶点1211个，与桃红四物汤共同靶点基因133个，运用Venny2.1平台，绘制得到药物-疾病的韦恩图。见图2。

图2 桃红四物汤与LI-RI共同靶点

4 PPI网络构建

将得到的133个交集基因，导入到STRING 11.5数据库中，得到PPI网络图与TSV文件，PPI网络中含有132个节点（隐藏了1个不参与网络的节点），2551条相互作用线，见图3；将TSV文件导入到Cytoscape3.8.2软件中，运用“Network analyze”功能进行拓扑分析，得到排名前11的为核心靶点，见图4（X 轴表示度值，Y 轴表示靶点名称）。degree值越大，证明该节点在网络中发挥的作用越重要。

图3 桃红四物汤治疗LI-RI靶点PPI网络

图4 PPI网络中排名前11的关键靶点

5 GO富集分析

将得到的133个交集基因靶点导入到Metascape平台中，进行GO富集，得到生物过程1788个，细胞组分100个，分子功能152个，整理数据后得到排名前20的生物过程（Biological Process，BP）、细胞组分（Cellular Components，CC）、分子功能（Molecular Functions，MF）。然后利用微生信在线绘制富集分析柱状图。见图5（X轴表示 GO 分析条目，Y轴表示富集分数）。BP富集包括对脂多糖的反应、炎症反应、细胞凋亡反应、平滑肌细胞增殖调节等。CC富集包括膜筏、细胞外基质、细胞器外膜、内质网腔等。MF富集包括DNA结合转录因子、蛋白激酶结合肿、瘤坏死结合因子受体结合、抗氧化活性等。将GO富集排名前20条目，用气泡图表示，见图6（气泡越大表示基因越多，颜色越深表示P值越大） 。

图5 GO富集分析分类

图6 GO分析气泡

6 KEGG信号通路富集分析

将得到的133个交集基因靶点导入到Metascape平台中，进行KEGG富集，分析得到202条信号通路，主要包括AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路等，整理数据后得到排名前20的信号通路，利用微生信在线绘制富集分析柱状图，见图7（Y轴表示信号通路，X轴表示基因数目）。选取关键通路并整理数据后，数据导入Cytoscape3.8.2软件得到“靶点-信号通路”网络，见图8（蓝色六边形表示通路，黄色菱形表示靶点）。

图7 KEGG通路富集分析

图8 靶点-通路网络

7 分子对接结果

将得到主要有效成分槲皮素、山柰酚、木犀草素与核心靶点ALB、TNF、AKT1进行对接，对接分数见表2。运用 Pymol 软件对结果进行输出优化，见图9。结合能越低，表示靶点蛋白与有效成分结合能力越强[13]。

图9 有效成分与核心靶点的分子对接

表2 主要有效成分与核心靶点对接情况

讨 论

LI-RI的临床表现为肢体皮肤苍白、肿胀、疼痛，更严重的会导致截肢或者死亡。中医根据其临床表现认为其病机主要是气行不畅，血瘀脉中[14]。一般以活血化瘀、理气通络为治法[15]，治疗后气血通畅，筋骨肌肉得到濡养，临床症状可以得到好转。活血化瘀经典方桃红四物汤具有活血化瘀，祛瘀通络的作用。同时桃红四物汤具有抗炎、止痛、消肿的功效[16-17]，符合西医治疗LI-RI的原则。申震等[18]发现桃红四物汤可以减轻LI-RI中的炎症反应及其细胞凋亡率。

通过TCMSP数据库检索出桃红四物汤主要有效成分，对药物-成分靶点网络进行拓扑分析，发现排名前三的有效成分为槲皮素、山柰酚、木犀草素。有研究表明[19]，槲皮素可以直接抑制炎症因子（TNF-α、IL-6等）的分泌，也可以通过抑制核因子κB的表达，来抑制炎症介质的分泌。山奈酚是一种黄酮类化合物，有研究证实[20-22]其具有抗氧化、抗炎、改善血液动力学作用。沈瑞明等[23]发现木犀草素可以舒张血管，影响纤维细胞增殖和分化。

通过PPI网络筛选得到degree值排名前3位分别是是ALB（白蛋白）、TNF（肿瘤坏死因子）、AKT1（苏氨酸-蛋白激酶）。ALB具有维持血液渗透压、具有抗休克、调节细胞凋亡、减轻水肿、抗凝等功能，ALB水平下降，则机体免疫功能受损，淋巴细胞数量下，吞噬作用减弱，并影响组织代谢及其功能[24]，导致LI-RI患者肢体水肿等症状。TNF可以通过NF-κB、MAPK 信号通路刺激炎症反应的发生[25]，加重LI-RI的疼痛、组织坏死等临床症状。申震等[26]研究发现肿瘤坏死因子α与LI-RI有密切关系，则血清中TNFα的表达水平可以作为评估LI-RI的临床指标。

桃红四物汤治疗LI-RI的GO富集和KEGG信号通路富集分析得出，其中生物过程与分子功能都与炎症反应、细胞凋亡、信号通路等有关，在治疗LI-RI中起重要作用。KEGG信号通路分析发现桃红四物汤治疗LI-RI可能与AGE-RAGE、TNF、IL-17等信号通路有关。

AGE-RAGE信号通路[27]通过细胞内氧化应激反应激活NF-κB信号通路[28]，诱导多种炎症因子的表达增加，促进细胞的增殖、分化与凋亡。有研究表明桃红四物汤可以降低LI-RI中的细胞凋亡率[16]。TNF信号通路参与许多细胞活动，例如炎症反应、细胞凋亡等[29]，亦可以对其他通路起激活作用，诱发连锁反应，导致LI-RI患者的疼痛产生或加剧[30]。IL-17信号通路的激活，与炎症因子的产生、免疫应答有关，可以导致多种炎症反应的发生和自身免疫疾病的形成[31-33]。

通过分子对接可以看到有效成分与核心靶点的结合能均≤-6kcal/mol，对接最稳定是木犀草素与ALB的结合（-9.8kcal/mol），所有的结合位点均有稳定的氢键、疏水键，构建稳定，分子结果表示桃红四物汤有效成分能与受体蛋白稳定结合，对LI-RI有治疗作用。

综上所述，本研究通过网络药理学与分子对接方法，对桃红四物汤治疗LI-RI的作用机制进行了探讨，桃红四物汤治疗LI-RI具有多靶点、多通路等特点，其机制可能与桃红四物汤中有效成分槲皮素、山柰酚、木犀草素等，通过ALB、TNF、AKT1等靶点，激活AGE-RAGE、TNF、IL-17等信号通路，调控炎症反应与细胞凋亡等有关，为桃红四物汤治疗LI-RI提供了理论支持。但是，目前仍需要更多的相关实验和临床研究，去进一步研究其具体的治疗机制。